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研究背景与目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫病。其病理改变包括关节滑膜炎症、血管翳形成、骨质破坏等。RA 成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocyte,RA-FLS)作为滑膜组织的主要组成部分,参与了 RA疾病的发生发展。RA-FLS具有类似肿瘤细胞样过度增殖、迁移以及侵袭的生物学特性。长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA)在肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病病理进展中起关键作用,有可能成为疾病诊断及治疗的生物学靶点。越来越多的研究表明,LncRNA作为一种重要的基因表达调控元件,可以通过介导组蛋白修饰以表观遗传调控的方式调控相关基因的表达。人LncRNA NUTM2A-AS1基因定位于10q23.2,其cDNA长度为825bp,迄今为止有关NUTM2A-AS1的生物学功能尚不清楚,与RA发生发展的关系尚未见报道。本实验通过研究NUTM2A-AS1在RA-FLS中的表达水平,并探究其对RA-FLS迁移及侵袭的影响及其可能的作用机制。本研究结果可以进一步完善我们对RA发病及RA-FLS迁移和侵袭机制的理解,有可能为RA的治疗提供新的理论支持。研究方法:1.对正常人的成纤维样滑膜细胞(NFLS)和RA患者的成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)中的lncRNA进行基因芯片分析,并用RT-qPCR对基因芯片结果进行验证。2.构建表达NUTM2A-AS1的慢病毒载体;利用HEK293T细胞进行慢病毒包装;将表达NUTM2A-AS1的慢病毒感染RA-FLS(MH7A细胞株),通过嘌呤霉素筛选稳定后,采用RT-qPCR进行验证。3.采用CCK-8实验、EdU染色实验及流式细胞术检测过表达NUTM2A-AS1对RA-FLS的活力、增殖和凋亡的影响。4.采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移及侵袭实验检测了过表达NUTM2A-AS1对RA-FLS迁移和侵袭的影响。5.采用罗丹明标记的鬼笔环肽对过表达NUTM2A-AS1的RA-FLS以及对照组细胞中的F-actin细胞骨架系统进行染色,观察过表达NUTM2A-AS1对RA-FLS肌动蛋白细胞骨架装配的影响。6.设计、合成NUTM2A-AS1的荧光探针,采用RNA-FISH实验方法观察RA-FLS 中 NUTM2A-AS1 的分布。7.通过对NUTM2A-AS1进行体外转录和生物素化标记,采用RNA沉淀实验(RNA pull-down assay),将沉淀物采用蛋白质谱分析检测,并通过Western blot进行验证。8.利用筛选建立NUTM2A-AS1基因过表达的稳定细胞模型(含对照病毒组),提取总RNA,进行转录组测序以及生物信息学分析差异基因表达谱的变化,通过RT-qPCR验证相关基因的表达。9.采用Western blot方法检测过表达NUTM2A-AS1的RA-FLS中组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化修饰(H3K9me2)和组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化修饰(H3K4me3)的水平以及与上皮间质转化(EMT)相关基因的表达水平。研究结果:1.基因芯片结果显示,与NFLS相比,RA-FLS中有1028个LncRNA表达上调,有1170个LncRNA表达下调,其中NUTM2A-AS1表达明显下调;同时,采用RT-qPCR验证结果显示,与NFLS相比,NUTM2A-AS1在RA-FLS中的RNA表达水平显著下调。2.成功构建了表达NUTM2A-AS1的慢病毒载体、包装了表达NUTM2A-AS1的慢病毒;慢病毒感染RA-FLS(MH7A细胞株)后通过嘌呤霉素筛选建立了稳定过表达NUTM2A-AS1的细胞模型,通过RT-qPCR实验证实过表达NUTM2A-AS1的RA-FLS细胞模型构建成功。3.CCK-8实验、EdU染色实验及流式细胞术检测结果表明,过表达NUTM2A-AS1对RA-FLS的活力和凋亡无明显影响,但可以促进细胞增殖。4.细胞划痕实验结果显示,过表达NUTM2A-AS1可以在二维层面抑制RA-FLS的迁移;Transwell迁移和侵袭实验结果显示,过表达NUTM2A-AS1可以在三维层面上明显抑制RA-FLS的迁移与侵袭。5.免疫荧光染色实验结果显示,过表达NUTM2A-AS1可以影响肌动蛋白细胞骨架纤维的重排,使张力纤维数目增多,片状伪足和丝状伪足的数量减少。6.RNA-FISH实验结果显示,NUTM2A-AS1在RA-FLS的细胞核和细胞质中均有分布,尤以细胞核分布明显。7.RNApull-down沉淀物的蛋白质谱检测及分析结果显示,RA-FLS中NUTM2A-AS1的结合蛋白中含有参与表观遗传调控(组蛋白乙酰化和甲基化修饰活性)的KAT8和RIOX2,并通过Western blot进行了验证,明确了 RIOX2为RA-FLS中NUTM2A-AS1的结合蛋白。8.RNA-seq检测结果分析,与对照组相比,NUTM2A-AS1过表达组细胞中1369个基因表达显著上调、105个基因表达下调,发现与EMT相关的基因表达显著改变,其中 CDH1(E-cadherin)、CTNNB1(β-catenin)显著上调,而 CDH2(N-cadherin)以及MMP14则显著下调。采用RT-qPCR进行了结果的验证。9.Western blot实验结果显示,过表达NUTM2A-AS1的RA-FLS中H3K9me2和H3K4me3的蛋白水平显著下调,E-cadherin和β-catenin的蛋白水平显著上调,但不影响N-cadherin的表达。结论:1.RA-FLS中NUTM2A-AS1的表达明显下调。2.过表达NUTM2A-AS1可以促进RA-FLS的增殖,抑制细胞的迁移、侵袭,影响肌动蛋白细胞骨架纤维的重排,但对细胞活力和凋亡无明显影响。3.LncRNANUTM2A-AS1可能通过与具有组蛋白去甲基化酶活性RIOX2的结合影响RA-FLS中H3K9me2和H3K4me3的水平,进一步调控细胞中与上皮间质转化(EMT)相关的基因表达,从而影响RA-FLS的迁移和侵袭。