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针对当前抗肿瘤效应物美登素的类似物安丝菌素的发酵生产技术尚处于初级阶段,与其他成熟的大发酵产品相比,产品纯度、主产物相对含量、杂质种类及含量等质量指标普遍不高的现状,本研究以珍贵束丝放线菌橙色亚种(Actinosynnema pretiosum subsp.Auranticum ATCC 31565)为生产菌,分别在摇瓶和10L级发酵罐上建立了成熟的发酵工艺,作为后续生产的标准对照。摇瓶级别的初始对照水平为:采用Y3YM培养基(麦芽糖25 g/L;玉米糊精30 g/L;棉籽饼粉30 g/L;酵母浸膏5 g/L;氯化钙10 g/L;碳酸钙5 g/L;异丁醇1 g/L;灭菌前pH7.5±0.2),摇瓶装液量30 mL/250 mL,26℃/220 rpm振荡培养7d所得安丝菌素总效价为200～250 mg/L,主产物安丝菌素P3组分(A-P3,五种同系物之一)的占比(P3%)达97%～98%。10 L发酵罐上的初始对照水平为:运行10 d放罐,安丝菌素总效价264.88 mg/L,其中P3%=94%(罐上工艺条件为:底料采用Y3YM培养基,初始装液量6 L;接种量8%;初始通气量0.5 vvm,视溶氧情况逐步调升至1 vvm;罐压0.8～1.2 kg/cm2,视DO状况调整;起始搅拌转速300 rpm,视溶氧水平上调,最高不超过700 rpm;接种前KOH调pH7.2,发酵全程pH自然;26℃恒温培养)。接下来,将上述工艺下制得的发酵液作为研究材料,以安丝菌素P3标准品为参照物,综合利用高效液相色谱(HPLC)、液质联用仪(LC-MS)、高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振(NMR)等分析手段,从特征峰的相对保留时间、分子量、核磁氢谱等分析数据入手,对发酵液中安丝菌素P3组分及其同系物,以及主要杂质进行了定位、定性和定量分析。其中,确定该菌株的发酵液中含有P2/P3/P3’/P4/P4’共五种安丝菌素同系物;除此以外,还对HPLC谱图上8种吸收峰面积比较大的杂质进行了研究:以A～H分别对其命名,逐一分析了其分子量,并借助ChemDraw等工具对其中的5种杂质进行了结构拟合。由此得知,A/B/C三种最主要杂质中,杂质A、杂质B分别是安丝菌素P3(A-P3)母核生物合成过程中缺失-CH3和缺失-CI的中间产物;杂质C暂无法确定其结构,但由于其出峰位置极为接近主产物P3,直接影响P3组分的纯化,因而也列为后期发酵工艺优化研究中需要控制其生成量的重点对象。最后,基于上述发酵液组分分析的结果,以安丝菌素同系物组成(各组分相对占比)以及重要杂质的种类和数量控制为目的,重点对10L级发酵罐上的发酵控制工艺及其配套培养基组成进行优化研究,在保证安丝菌素总产率不降低的情况下,最终获得主产物P3组分占比高,杂质种类少且含量低的高质量发酵液。本研究最终确定了一套适用于10L级发酵罐的主发酵工艺:采用T3配方培养基,接种量5%,连续流加异丁醇,搅拌转速300～400 rpm,通气量0.5～1vvm,26℃恒温培养13 d后安丝菌素总效价286.29mg/L,P3%=95%,杂质A相对含量<0.1%,ABC三种重要杂质总相对含量<5%。在此基础上最终制备得到的终产品质量指标为:安丝菌素同系物总色谱纯度达99.9%,其中P3%=99.1%,最大单杂<0.1%,达到较高质量标准。