2013年初,一种新型禽流感病毒H7N9从活禽到人的跨种传播,对人类健康造成了极大的威胁,并引起社会的恐慌。本实验室前期工作已经对H7N9 NS1蛋白的功能进行了初步研究,并初步发现将S212位和1178位两个氨基酸位点突变后会影响NS1的功能。为进一步揭示上述两个位点在NS1蛋白发挥拮抗宿主抗病毒应答中的关键作用,本课题对S212位和1178位氨基酸进行了深入研究。本研究将H7N9 NS1蛋白及其突变体（NS1 E70K、NS1 T143A、NS1 S212P）的真核表达质粒转染到293T细胞,24h后感染流感病毒A/WSN/33（H1N1）12h,运用RT-PCR方法探讨S212位氨基酸位点突变对宿主天然免疫应答的影响。然后,进一步研究NS1蛋白氨基酸位点突变影响宿主天然免疫的机制。将H7N9NS1蛋白及其突变体质粒转染至293T细胞24h,分别用 A/WSN/33（H1N1）和 A/PR/8/34（H1N1）ΔNS1这两个流感病毒毒株感染12h后,采用RT-PCR和real-time PCR方法检测RIG-I、MDA5、TLR3和ISGs等宿主因子的mRNA表达水平;接着运用Western blotting的方法检测STAT1磷酸化水平的变化情况;最后运用Western blotting和空斑实验检测流感病毒的复制情况。实验结果如下:1)相比于NS1野生型（NS1-WT）,NS1-S212P突变抑制了 H7N9 NS1蛋白拮抗宿主天然免疫应答的功能,使得RIG-I所介导的免疫应答通路更加活化;2)相比于NS1-WT,NS1-S212P突变后STAT1的磷酸化水平显著提高,表明NS1-S212P突变削弱了 H7N9 NS1蛋白拮抗宿主细胞抗病毒应答功能,使得JAK-STAT信号通路激活,最终诱导产生更高水平的ISGs;3)NS1-S212P突变后,流感病毒NP蛋白的表达水平及病毒滴度相对于NS1-WT显著降低,表明NS1-S212P突变改变了宿主细胞内环境,从而抑制流感病毒的复制。将 H7N9NS1 蛋白及其突变体（NS1 E70K、NS1 T143A、NS1 I178V、NS1 S212P）的真核表达质粒转染到293T细胞24h,再用蛋白质合成抑制剂 CHX（cycloheximide）处理细胞 32h,Western blotting检测NS1蛋白的表达水平,发现1178位氨基酸位点突变改变了 NS1蛋白的稳定性。随后,研究该位点突变之后NS1蛋白稳定性下降的机制。分别运用蛋白酶体抑制剂（MG132）、溶酶体抑制剂（NH4CL、Chloroquine）与CHX共同处理293T细胞,检测NS1-I178V的降解途径。实验结果如下:1)与E70K、T143A和S212P位点突变相比,I178V位点突变使H7N9NS1蛋白的稳定性下降;2)NS1-I178V的半衰期约为16h,而NS1-WT的半衰期则大于32h,进一步说明I178V突变可降低H7N9 NS1蛋白的稳定性;3)用NH4CL、Chloroquine处理后,NS1-I178V蛋白水平仍然降低;但是用MG132处理后NS1-I178V蛋白降解明显被抑制,说明I178V突变使NS1蛋白经过泛素-蛋白酶体途径降解。综上所述,研究结果表明H7N9NS1蛋白S212位氨基酸是其拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的关键位点,而1178位氨基酸是维持其蛋白稳定性的重要位点。本课题的研究成果为阐明NS1蛋白氨基酸位点变异在H7N9禽流感病毒致病中的作用提供科学依据,也为研制抗H7N9禽流感病毒药物以及新型疫苗的研发提供理论基础。