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子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)为育龄期女性常见病、多发病,发病率10%-15%。EMs影响卵泡发育是导致不孕的重要原因。50%的EMs患者合并不孕。导师赵瑞华教授应用活血疏肝补肾中药序贯治疗可有效改善EMs不孕患者卵泡发育,提高腹腔镜术后妊娠率与活产率。前期实验研究表明活血消异方可改善EMs模型大鼠IVF-ET促排卵数、受精数,提高EMs模型大鼠IVF-ET妊娠率与活产率。故本研究从子宫内膜异位症影响卵泡发育的角度入手,立足细胞凋亡与细胞自噬对卵泡发育的影响,开展动物实验与细胞实验以阐明活血消异方改善卵泡发育的机制。目的(1)探讨活血消异方对子宫内膜异位症大鼠卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的影响,并通过ROS-JNK信号通路阐明活血消异方可能的作用机制。(2)探讨活血消异方含药血清对H2O2诱导的氧化应激大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响与作用机制。方法动物实验:8周龄雌性SD大鼠30只,分为空白组、假手术组、模型组、活血消异方组。活血消异方组予活血消异方汤剂,空白组、假手术组、模型组予蒸馏水,连续灌胃15天后,取大鼠腹主动脉血,检测血清ROS、T-SOD、CAT氧化与抗氧化指标;取大鼠卵巢组织行HE染色,光镜下观察各级卵泡形态,并计数;免疫组化染色定位颗粒细胞,并比较Bax、Bcl-2、caspase-3的表达;TUNEL染色观察卵巢颗粒细胞凋亡情况并计算凋亡率;Western blot检测p-JNK、Bax、Bcl-2、caspase-3、Beclin-1、LC3II 蛋白的表达;qRT-PCR 检测 Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 的表达;透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构,计算自噬体胞质面积比。细胞实验:21-25天雌性SD大鼠50只,应用机械分离与胰酶消化结合的方法采集大鼠卵巢颗粒细胞;免疫荧光染色观察兔抗FSHR受体多克隆抗体表达,检验卵巢颗粒细胞纯度;观察颗粒细胞生长状态,绘制生长曲线。结合文献与细胞生长状态,应用50 μm、100 μm、200 μm、500 μm、1mm浓度H2O2干预卵巢颗粒细胞,CCK-8法筛选合适浓度,建立大鼠卵巢颗粒细胞氧化应激模型;5%,10%,20%活血消异方含药血清干预,CCK-8法筛选活血消异方含药血清浓度与干预时间;应用200nm、400nm、800nm JNK信号通路抑制剂SP600125干预氧化应激的卵巢颗粒细胞,CCK-8法筛选合适的浓度;将对数生长期的卵巢颗粒细胞随机分为空白组、H202干预的氧化应激模型组(模型组)、活血消异方含药血清组(中药组)、JNK通路抑制剂组。经干预后激光共聚焦显微镜观察细胞内ROS表达,并比较各组平均光密度值;激光共聚焦显微镜观察TUNEL染色,并比较各组凋亡率;Western blot检测p-JNK、Bax、caspase-3蛋白表达;透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构。结果动物实验:(1)与空白组、假手术组比较,模型组血清ROS升高,T-SOD、CAT降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与模型组比较,活血消异方组血清ROS降低,T-SOD、CAT上升,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)HE染色:与空白组、假手术组比较,模型组次级卵泡数目降低(P<0.05),与模型组比较,活血消异方组次级卵泡数目增加(P<0.05);(3)免疫组化染色:模型组大鼠卵巢颗粒细胞排列散乱,空白组、假手术组、活血消异方组大鼠卵巢颗粒细胞排列整齐;与空白组、假手术组比较,模型组Bax、caspasae-3表达升高,Bcl-2表达降低(P<0.01),与模型组比较,活血消异方组Bax、caspase-3表达降低,Bcl-2表达升高(P<0.01);(4)TUNEL染色:与空白组、假手术组比较,模型组卵巢颗粒细胞凋亡率明显升高(P<0.001),与模型组比较,活血消异方组凋亡率明显降低(P<0.001);(5)Western blot:与空白组、假手术组比较,模型组p-JNK、Bax、caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2、Beclin-1、LC3II蛋白表达降低(P<0.05),与模型组比较,活血消异方组p-JNK、Bax,caspase-3蛋白表达下降,Bcl-2、Beclin-1、LC3II蛋白表达升高(P<0.05);(6)qRT-PCR:与空白组、假手术组比较,模型组Bax mRNA、caspase-3 mRNA表达升高,Bcl-2 mRNA表达降低(P<0.01),与模型组比较,活血消异方组Bax mRNA、caspase-3 mRNA 表达降低,Bcl-2 mRNA 表达升高(P<0.05);(7)透射电镜:模型组大鼠卵巢颗粒细胞超微结构破坏明显,空白组、假手术组、活血消异方组超微结构基本正常;空白组、假手术组、模型组、活血消异方组卵巢颗粒细胞自噬体胞质面积比差异无统计学意义(P<0.05)。细胞实验:(1)应用机械分离法与胰酶消化法相结合采集的卵巢颗粒细胞纯度为98%,符合细胞实验要求;卵巢颗粒细胞生接种密度应为96孔板5 × 104个/孔(100 μL);应用200 μm的H2O2诱导建立氧化应激的卵巢颗粒细胞模型;选用活血消异方含药血清最佳浓度为10%,干预时间为24h;JNK信号通路抑制剂SP600125干预浓度为800nm;(2)细胞内ROS表达:与空白组比较,模型组、中药组、JNK通路抑制剂组细胞内ROS平均光密度值升高(P<0.05),与模型组、JNK通路抑制剂组比较,中药组颗粒细胞内ROS降低(P<0.05);(3)TUNEL染色:与空白组比较,模型组、中药组、JNK通路抑制剂组凋亡率升高(P<0.05),与模型组比较,中药组、JNK通路抑制剂组凋亡率降低(P<0.05);(4)Western blot:模型组 p-JNK、Bax、caspase-3 蛋白表达较空白组、中药组、JNK通路抑制剂组升高;(5)透射电镜:模型组卵巢颗粒细胞超微结构明显破坏,中药组卵巢颗粒细胞超微结构损伤较模型组小。结论(1)活血消异方可能通过ROS-JNK信号通路,改善子宫内膜异位症大鼠氧化应激状态,减少卵巢颗粒细胞凋亡,增加卵巢颗粒细胞自噬,改善子宫内膜异位症大鼠卵泡发育。(2)活血消异方含药血清可能通过抑制ROS-JNK信号通路,降低H202诱导的氧化应激卵巢颗粒细胞凋亡。