研究背景子宫内膜异位症（Endometriosis,EM）是一种常见的妇科疾病,在育龄期女性中的发病率大约为10%,可以引起痛经、慢性盆腔痛和不孕等症状,在严重影响女性身心健康的同时给社会造成巨大的经济负担。目前对该疾病的治疗方法有限,并且均存在副作用大和治疗后易复发的缺点。但是子宫内膜异位症发病机制尚不明确,经血逆流可能是其诱因,免疫微环境的改变在EM的发病中发挥重要作用。深入机制研究,探索针对发病机制的对因治疗是内异症研究领域一个亟待解决的难题。巨噬细胞作为免疫微环境的重要组成部分,其功能的异常激活可能在EM的发生和发展中起到决定性的作用。如果剔除腹腔中的巨噬细胞再进行动物造模,EM病灶生长受到明显抑制;向小鼠EM模型腹腔中过继转移经典途径激活的M1巨噬细胞能够抑制疾病发展,而过继转移选择性激活的M2巨噬细胞则促进疾病的进展。但是目前的研究对于巨噬细胞在EM疾病中的极化状态仍旧存在诸多矛盾的结果:有结果表明,在EM患者病灶和腹腔中M2巨噬细胞占优势;与之相反,有研究者发现EM患者病灶中M2巨噬细胞数量降低;还有研究结果显示EM患者腹腔巨噬细胞培养上清中的M1代表性细胞因子（如IL-1β、TNF-α）及M2代表性细胞因子（IL-10）均增加。综上所述,巨噬细胞在EM发生和发展中的极化状态和发挥作用的具体机制尚不明确,研究EM中巨噬细胞的极化状态并明确其对疾病进程的影响,是开发针对性治疗的方向之一。巨噬细胞的极化状态并非一成不变,当微环境发生改变时,其极化状态能够随之改变,而细胞外囊泡（EVs）尤其是其中的外泌体,是调节巨噬细胞功能的重要方式之一。EVs能够逃避单核巨噬细胞吞噬系统,在循环中保持稳定;在体内EVs具有穿越生物屏障的能力,对特定组织具有一定的靶向性;同时EVs易储存运输且在保存过程中生物功能损失较少。EVs的这些特性使其发展成为一种新的载体,用于递送药物或者在体内环境中调节细胞功能。除上述特点外,巨噬细胞作为免疫细胞,其产生的EVs又具有独特的免疫抑制或者免疫刺激功能,是免疫治疗的重要工具。但是EVs在自然状态下分泌量有限,这是限制其成为疾病治疗方法的原因之一,利用人工手段提高EVs的获得量能够突破这一限制。针对巨噬细胞的功能特点和EVs的天然优势,开发基于EVs的免疫治疗是EM领域具有创新性的研究方向。研究目的1.明确EM患者异位病灶和腹腔中巨噬细胞的功能状态,并探究该功能状态的巨噬细胞在EM侵袭性生长和血管形成中的作用。2.探索人工制备M1巨噬细胞衍生纳米囊泡（M1NV）的可行性,并研究M1NV是否能够对M2巨噬细胞具有再极化作用,体外探索M1NV对EM疾病中的侵袭性生长和血管形成的直接和间接作用。3.探索M1NV在体内复杂的免疫环境中是否通过再极化巨噬细胞对EM的发展发挥抑制作用,并对其安全性进行评估。研究内容和方法1.针对既往研究中的矛盾结果,本研究从临床出发,重点关注Ⅲ-Ⅳ期EM患者中的巨噬细胞功能状态及其在疾病中的作用。收集临床患者标本,通过多色免疫组化、流式细胞术等技术手段,探索免疫微环境中巨噬细胞的功能状态;并利用共培养体系,研究该状态的巨噬细胞对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞（EM-ESC）迁移和侵袭的作用;通过小管形成实验,研究其对血管生成的影响。2.针对巨噬细胞分泌的EVs具有免疫调节功能但是自然状态下分泌量低下的情况,在本研究中通过连续机械挤压的方法制备M1巨噬细胞纳米囊泡（M1NV）。通过透射电镜（TEM）观察、纳米颗粒示踪（NTA）、RT-PCR和流式细胞术等技术手段研究M1NV的物理性质和生物学特性;通过条件培养,观察M1NV对已经极化的巨噬细胞的再极化作用,以及其直接对EM-ESC迁移和侵袭以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）血管形成的直接作用;利用共培养体系研究M1NV再极化的巨噬细胞对EM-ESC迁移和侵袭及HUVEC血管形成的作用。3.针对体内免疫应答复杂,M1NV作为外源物可能会被体内免疫系统清除的情况,本研究中使用腹腔注射子宫内膜碎片法在免疫功能正常的小鼠中构建EM模型,研究M1NV在体内对EM病灶发展的作用,并应用流式细胞术和免疫组化探索其可能的机制;流式细胞术体外检测M1NV作用后的细胞凋亡比例观察其在体外对细胞的毒性作用,小动物活体成像系统（IVIS）观察M1NV在不同器官的聚集情况,并通过H＆E染色,观察各脏器的损伤情况,以便评估M1NV治疗的安全性。研究结果1.在Ⅲ-Ⅳ期子宫内膜异位症患者的异位病灶和腹腔中,巨噬细胞的功能状态均以M2型为主。M2巨噬细胞与EM-ESC共培养后,能够明显的促进EM-ESC的迁移和侵袭;而M2巨噬细胞与HUVEC共培养之后,能够显著促进HUVEC小管的形成。2.人工制备的M1NV在形态、粒径和Zeta电位上与自然分泌的外泌体相似,但是同样数目的亲代细胞,得到M1NV的总蛋白量是自然分泌外泌体的4倍,颗粒数是外泌体的10倍。3.M1NV中所含有的M1巨噬细胞标志性mRNA显著高于对照组。M1NV培养诱导EM-ESC和HUVEC后,能够显著抑制EM-ESC的迁移和侵袭能力,并且抑制HUVEC的小管形成能力。M2极化的巨噬细胞能够被M1NV再极化为M1样巨噬细胞（Re-M2）,Re-M2能够显著抑制EM-ESC迁移和侵袭,抑制HUVEC的小管形成作用,并且Re-M2能够逆转EM-ESC的促血管生成功能,Re-M2的这些作用与M1巨噬细胞类似。4.小鼠体内试验表明,造模后7天腹腔注射M1NV能够显著减小EM病灶的体积和重量,但对病灶数量没有显著影响。细胞免疫荧光和流式细胞术分析分析发现,M1NV组小鼠腹腔中的巨噬细胞向M1极化。进一步分析发现M1NV主要是通过影响小腹腔巨噬细胞（SPM）发挥作用,而对大腹腔巨噬细胞（LPM）没有显著的影响。通过比较LPM/SPM的比值,我们发现M1NV不会改变大小巨噬细胞的比例。体外细胞凋亡实验检测显示治疗剂量的M1NV不会诱导靶细胞的凋亡;IVIS检测显示腹腔注射的M1NV不会在体内的重要脏器聚集,流式检测发现这些M1NV主要被腹腔巨噬细胞所吞噬,重要脏器的H＆E染色没有发现明显的结构改变。研究结论1.子宫内膜异位症患者病灶和腹腔中的巨噬细胞向M2极化,并且向M2极化的巨噬细胞能够促进EM-ESC的迁移和侵袭,并促进血管的形成。2.M1NV在体外能够直接抑制EM-ESC的侵袭和迁移及血管形成,并且也能够通过再极化M2巨噬细胞间接的达到抑制EM-ESC侵袭和迁移及血管的形成的效果。3.M1NV在体内能够有效的抑制子宫内膜异位症的进展,并且不会发生明显的器官损伤。