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目的研究七氟烷对血管内皮细胞迁移功能的影响,以及涉及的分子生物学机制。内容1.体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),适当条件下进行七氟烷气体暴露、划痕实验以观察七氟烷对血管内皮细胞迁移功能的影响。2.设计蛋白印迹(western blot,WB)实验、定量聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)实验以检测HUVECs的血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)表达差异。3.转染小干扰RNA(si RN A)抑制VE-cadherin基因表达以验证VE-cadherin在七氟烷抑制血管内皮细胞迁移中的确切作用。方法第一部分,体外实验中的HUVECs均培养于直径为10 cm的无菌培养皿中,实验操作均在细胞长满培养皿的80%~90%时进行。将HUVECs随机分为四组(每组包含4个培养皿的细胞),分别为对照组,七氟烷暴露0.5 h组,1 h组和2 h组。对照组中HUVECs暴露于5%CO2,21%O2中2 h,七氟烷暴露组中的HUVECs暴露于5%CO2,21%O2和2%七氟烷,暴露时间分别为0.5 h、1 h和2 h。气体暴露后分别对四组细胞进行划痕实验,12 h后观察HUVECs的迁移距离是否存在差异,并对各组HUVECs进行定量PCR实验以检测VE-cadherin的表达情况,探讨其可能涉及的分子生物学机制。第二部分,对体外培养的HUVECs转染VE-cadherin si RNA,满足条件的HUVECs进行随机分组和气体暴露(每组样本量同第一部分),分组情况为对照组(HUVECs未转染VE-cadherin si RNA,气体暴露不包含七氟烷),sevo组(HUVECs未转染VE-cadherin,气体暴露包含七氟烷),si RN A组(HUVECs转染VE-cadherin,气体暴露不包含七氟烷)和sevo+si RNA组(HUVECs转染VE-cadherin,气体暴露包含七氟烷)。气体暴露时间均为2 h,流量均为2 L/min,七氟烷浓度均为2%。设计蛋白印迹实验,定量PCR实验以检测各组之间VE-cadherin的表达差异,并进行划痕实验验证各组细胞之间的迁移距离是否存在差异。采用SPSS 13.0软件包对所有实验数据进行分析整理。统计图表的绘制采用Graph Pad Prism(v5)软件。成果1.第一部分中划痕实验12 h后,观察划痕距离发现,与对照组比较,在2%七氟烷中暴露2 h的HUVECs迁移距离显著缩短(P<0.01),细胞迁移功能受到显著抑制,而在2%七氟烷中暴露0.5 h和1 h的HUVECs迁移距离与对照组比较均无显著差异。2.第一部分中的定量PCR实验结果提示,在2%七氟烷中暴露2 h的HUVECs与对照组比较,VE-cadherin m RNA表达量明显上调(P<0.05),而在2%七氟烷中暴露0.5 h和1 h的HUVECs VE-cadherin m RNA表达量与对照组比较均无显著差异。3.第二部分中的蛋白印迹及定量PCR实验结果提示,转染VE-cadherin si RNA的HUVECs其VE-cadherin表达量与对照组比较显著降低(P<0.05),而转染VE-cadherin si RNA并在2%七氟烷中暴露2 h的HUVECs其VEcadherin表达量与对照组比较差异无统计学意义。4.第二部分中的划痕实验结果提示,划痕后12 h,转染VE-cadherin si RNA的HUVECs其迁移距离与对照组比较显著延长(P<0.05),而转染VE-cadherinsi RNA并在2%七氟烷中暴露2 h的HUVECs其迁移距离与对照组相比差异无统计学意义。结论2%七氟烷暴露2 h对HUVECs迁移功能有显著的抑制作用,其机制可能与七氟烷上调VE-cadherin的表达有关。