【摘 要】
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疯草(Locoweed)是含有苦马豆素(swainsonine,SW)的豆科棘豆属和黄苗属有毒植物的统称,动物过量采食后表现出共济失调、跛行、瘫痪等临床症状。疯草内存在波状芽管蠕孢菌(Undi
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疯草(Locoweed)是含有苦马豆素(swainsonine,SW)的豆科棘豆属和黄苗属有毒植物的统称,动物过量采食后表现出共济失调、跛行、瘫痪等临床症状。疯草内存在波状芽管蠕孢菌(Undifilumspp),该真菌与疯草中的毒性成分SW密切相关。研究该内生真菌中SW合成的路径,可以为调控疯草脱毒奠定基础,并提供理论依据。目前,疯草内生真菌合成SW的具体途径仍不确定,SW的提取率也较低,通过诱变手段可以有效调控SW的产率,为SW的进一步研究奠定基础。本试验主要对变异黄芪种子中的产SW内生真菌进行分离与鉴定,使用该内生真菌制备原生质体,并进行转化及再生,对该内生真菌进行诱导选育,为进一步阐明SW的合成机理及突变菌株的选育提供理论基础。1、从变异黄芪种子中共分离到3株能够产生SW的内生真菌,经过ITS、GPD序列的同源性比对和遗传进化分析,结果表明该菌株与波状芽管蠕孢菌的亲缘关系最近,根据形态结构和遗传进化分析结果将NM-UA001、NM-UA002、NM-UA003 3株菌鉴定为U.oxytropis。2、选取液体培养15d的NM-UA003菌丝,充分研磨后,使用0.6mol/L MgSO4作为缓冲液,酶解体系为纤维素酶+溶壁酶+蜗牛酶,3种酶组份的比例为1:1:1.2,室温下90 r/min振荡酶解2 h,U.oxytropis原生质体的生成量最大,达到8×107～1.2×108个/mL。采用真菌表达载体pAN7、pDL2、pFL2对疯草内生真菌原生质体进行体外转化,转化后可以在再生培养基上生长。3、分别选用UV和EMS、NTG诱变剂对内生真菌进行诱变,随机挑取79株诱变处理的菌株进行富集培养。各菌株SW合成效率分析结果表明,UV诱变处理,共获得6株SW产率发生显著变化的突变株(P<0.05);使用EMS诱变处理时,共获得12株SW产率显著变化的突变株(P<0.05);使用NTG诱变处理时,共获得8株SW产率发生显著变化的突变株(P<0.05)。
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