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目的：心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）病人死亡的首要原因，占尿毒症患者死亡率的50％以上。研究表明，血管钙化及其进展又是CVD发生的独立危险因素。近年来研究显示，CKD患者主要表现为中膜钙化，是一个由细胞介导的主动的、高度可调的程序化过程，类似于骨和软骨形成过程中的骨化，而血管中膜以平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）为主，其发生类成骨/成软骨样表型转化，其中关键的转录因子（如核心结合因子core-binding factor subunit alpha-1，Cbfa1/Runx2）表达增高，进而分泌一些胶原如Ⅰ型胶原（typeⅠ c ollagen，ColⅠ）和非胶原蛋白，在血管钙化中起着极为重要的作用。本研究旨在通过尿毒症患者血清模拟体内尿毒症环境，不同浓度对VSMCs进行干预，观察VSMCs钙化及Ⅰ型胶原表达情况，进而探讨尿毒症血清对VSMCs钙化的影响，分析Ⅰ型胶原在此过程中的作用机制，进一步探讨Ⅰ型胶原在尿毒症血管中膜钙化中的作用及机制。方法：1血清制备：选取自2010年6月至2011年7月于河北医科大学第四医院血液净化中心行维持性血液透析患者12例及正常健康志愿者10例，透析前清晨空腹采静脉血4ml离心后（1800rpm×15min），收集上清置于1.5ml的Eppendof管中，56℃灭活，0.22μm的滤膜过滤除菌，－80℃冷冻保存备用。2应用贴壁法进行血管平滑肌细胞原代培养，构建VSMCs细胞系，并应用形态学及免疫细胞化学方法对其进行鉴定。3实验分组及处理：VSMCs随机分为阴性对照组、健康人血清组及尿毒症血清组，阴性对照组采用含10%牛清的高磷（10mmol/L β－甘油磷酸）培养基培养，在此基础上分别给予不同浓度健康人血清及尿毒症患者血清进行干预，根据血清浓度，后两组各设5%、10%、15%（低、中、高）三个亚组，共干预6d，进行钙化测定及Cbfa1和ColⅠ检测。4运用茜素红（Alizarin red stain）及Von Kossa染色方法对VSMCs进行钙化染色；应用邻甲酚酞络合酮比色法测定细胞钙含量。5分别运用RT-PCR及Western-Blot方法研究不同浓度尿毒症患者血清对VSMCs中Cbfa1mRNA及Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平表达的影响。6统计学方法：用SPSS13.0统计学软件对所有数据进行统计学处理，实验结果用均数±标准差（x s）表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），用S-N-K检验（Student-Newman-Keuls，SNK）作多组间均数两两比较，相关分析符合双变量正态分布作Pearson积差相关分析，不符合双变量正态分布作Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1组织块贴壁法培养：原代培养3d即可见细胞爬出，约6～7d后融合成片，即可传代。倒置相差显微镜检观察及HE染色、瑞氏-姬姆萨染色可见细胞呈典型的“峰-谷”样表现，细胞呈梭形、星型或不规则形，以梭形为主，胞浆丰富，核大，圆形或椭圆形。免疫细胞化学法检测-平滑肌肌动蛋白抗体（-SMA actin）可见细胞胞浆表达强阳性，免疫反应产物呈棕黄色。2茜素红（Alizarin red stain）及Von Kossa钙化染色结果显示：与健康人血清组比较，不同尿毒症血清刺激后VSMCs钙化染色均加重，且随时间延长，钙化结节越明显。3钙含量检测结果显示：与阴性对照组相比，健康人血清刺激后钙含量无明显变化，尿毒症血清刺激后钙含量增高（P<0.05）；与健康人血清组比较，尿毒症血清组各浓度刺激后钙含量均增高，且呈浓度依赖性（P<0.05）。4RT-PCR检测各组VSMCs中Cbfa1mRNA的表达结果显示：与阴性对照组及健康人血清组比较，尿毒症血清刺激后Cbfa1mRNA表达均升高，低、中、高三个亚组间呈现浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。尿毒症血清组低、中、高三个亚组间两两比较，Cbfa1mRNA表达差异均有统计学意义，亦呈浓度依赖性（P<0.05）。5RT-PCR检测各组VSMCs中Col I mRNA的表达结果显示：与阴性对照组及健康人血清组比较，尿毒症血清刺激后Col I mRNA表达均升高，低、中、高三个亚组间呈现浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。尿毒症血清组低、中、高三个亚组间两两比较，Col I mRNA表达差异均有统计学意义，亦呈浓度依赖性（P<0.05）。6Western-Blot检测各组VSMCs中Col I蛋白的表达结果显示：阴性对照组、健康人血清组及尿毒症血清组细胞中均无Col I蛋白表达，而细胞上清液中均有Col I蛋白表达。与阴性对照组及健康人血清组比较，尿毒症血清刺激后细胞上清液中Col I蛋白表达均升高，低、中、高三个亚组间呈现浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。尿毒症血清组低、中、高三个亚组间两两比较，Col I蛋白表达差异均有统计学意义，亦呈浓度依赖性（P<0.05）。7尿毒症血清组Cbfa1mRNA表达与Col I mRNA表达相关性分析：尿毒症血清组Col I mRNA表达与Cbfa1mRNA表达呈正相关（r=0.784，P=0.012）。8尿毒症血清组Col I表达与钙含量变化相关性分析：尿毒症血清组Col I蛋白表达与钙含量呈正相关（r=0.878，P=0.002）。结论:1本实验采用组织块贴壁法成功地建立了大鼠VSMCs细胞系。2不同浓度尿毒症患者血清刺激后能够加重VSMCs钙化，呈浓度依赖性，可能与尿毒症毒素水平及VSMCs表型转化有关。3不同浓度尿毒症患者血清刺激VSMCs可使Ⅰ型胶原蛋白在基因及转录后水平上均表达增加，，呈浓度依赖性，可能与尿毒症毒素水平及Cbfa1基因水平表达增加有关。