目的氨是人体器官代谢氮营养素的中间形式,可分为游离氨与结合氨。游离氨于血液循环中依赖pH值的变化,在氨气和铵根离子间互相转化。正常生理情况下,健康人的体内游离氨浓度均保持在较低水平(<50uM)并不会产生对组织尤其是脑组织的损伤。相比之下,结合氨则主要以氨基酸和核酸等大分子形式参与生命组成。临床上,胃肠外科手术患者常常因患者不同程度的禁食可引起体内组织营养代谢的适应性改变,甚至伴有组织代谢分解的增强,从而引起体内氨代谢产生紊乱,从而会直接影响术后病人的术后恢复,相似的情况在严重创伤及感染的患者也常常可见,严重时由于游离氨代谢紊乱会导致肝性脑病的发生,后者多多见于门-体静脉分流术后的病人,但是具体机制复杂至今尚未明确。因此,多年来组织氨代谢的失衡对术后病人的影响一直备受关注[2],但具体的发生机制及作用环节并不清楚,尤其是研究组织氨代谢的手段和方法不多,这为临床上开发有效的防治策略带来了巨大的挑战。本课题组长期以来研究组织特异性氨代谢的途径及机制,通过借助神经视网膜组织与RPE(Retina Pigment Epithelium cells)/脉络膜组织间存在微环境这一生理特点,在国际上创新性建立起完善的组织氨代谢研究体系,可重点比较微环境中的氨代谢特征和共生关系,从而有利于对肝性脑病及其他氨代谢紊乱疾病的机制进行深入研究。方法 本研究利用气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS,)联用稳定同位素标记法(Stable Isotope-based Metabolic Analysis),用 6-8 周龄 C57 B6/J雄性小鼠为实验对象,进行体内和体外实验研究,追踪游离氨和氨基酸在不同组织中的代谢情况,重点比较了神经视网膜组织和视网膜色素上皮(Retina Pigment Epithelium cell,RPE)/脉络膜组织间微环境中的氨代谢变化。体内实验:稳定同位素15N标记氯化铵(Ammonium Chloride,NH4CL)后腹腔注射,分别在5分钟,15分钟,30分钟,60分钟时收集小鼠肝脏、视网膜神经上皮层、视网膜色素上皮层、大脑等组织以及血浆,用GC-MS进行测定、分析各代谢物的动态变化(每组实验数目N>6)。体外实验:采用神经视网膜组织培养法[3]利用稳定同位素15N标记和未标记的NH4CL、15N标记的氨基酸(包括15N-胺基-谷氨酰胺和15N-酰胺-谷氨酰胺、15N-天冬氨酸、15N-丙氨酸,23C-丙氨酸)离体培养新鲜的神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织(每组实验数目N>3)。在37℃ 5%CO2恒温箱孵育2小时后分别收集组织和培养液,用GC-MS测定稳态标记后的各代谢物变化[4]。结果2、游离氨代谢特点:为了解不同组织游离氨代谢特征,我们进行了体内动态标记实验:1)、神经视网膜组织与脑组织氨代谢特点。同位素15N都可以标记以下代谢物:谷氨酰胺、尿素、天冬酰胺、羟脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸和丙氨酸。这说明两种神经组织基本氨代谢通路类似。但是脑组织和神经视网膜组织对氨的清除速率不同:脑组织氨代谢物60分钟时蓄积达到高峰。而神经视网膜组织代谢物多在15分钟时蓄积达到高峰。2)、肝脏组织氨代谢特点。肝脏对氨的代谢和神经和脑组织明显不同:5分钟时有超过70%的谷氨酰胺被标记。尿素、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、羟脯氨酸和γ-氨基丁酸也都在5分钟时被标记。肝脏氨清除速率比脑组织和视网膜都快,氨代谢物在被快速标记后,30分钟时降至正常或接近正常水平。为进一步揭示氨代谢在不同组织的特点,我们利用视网膜组织易培养的优势,进行以下体外氨代谢研究。1)首先,我们检测非标记氨对主要糖和氨基酸代谢物的影响:1mM NH4Cl增加神经视网膜组织中代谢物谷氨酰胺近2倍,但是其它代谢物没有变化。5mMNH4Cl时,视网膜组织中,谷氨酰胺达4倍以上。除此之外,线粒体三羧酸循环代谢中间产物α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG)和琥珀酸各下降接近20倍和3倍。2)其次检测了标记氨对主要糖和氨基酸代谢物的影响:1mM同位素标记15N-NH4Cl培养时,神经视网膜组织中谷氨酰胺被标记并增加2倍多;5mM 15N-NH4Cl培养时,组织内98%的谷氨酰胺被标记,浓度增加了 4倍多,这与非标记的NH4C1培养结果一致。这些结果说明视网膜主要通过合成谷氨酰胺代谢氨。3)神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织代谢物变化在1mM 15N-NH4C1培养时基本一致。但5mM 15N-NH4Cl培养时,神经视网膜组织天冬氨酸和天冬酰胺被标记浓度增加2倍。在RPE/脉络膜中天冬酰胺没有被标记,浓度也没有变化。但是丙氨酸只在RPE/脉络膜中被标记了。说明神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织微环境中的氨代谢互相共生但又具有组织特异性。2、神经视网膜和RPE/脉络膜中主要氨基酸的氨代谢通路特点:因为微环境中谷氨酰胺、天冬氨酸以及丙氨酸的变化显著不同,我们用稳定同位素标记的这些氨基酸中的氨基,进一步探究它们的代谢通路特点。1)探究谷氨酸胺氨代谢通路特点。因谷氨酰胺有两个含氮基团,我们首先对15N-胺基-谷氨酰胺标记追踪。神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织中被标记的谷氨酰胺均接近80%。神经视网膜组织中被标记的谷氨酸和天冬氨酸较对照组,增加了 2倍,其余代谢物未被标记。RPE/脉络膜组织中,增加更明显分别为4倍和8倍。除此之外,被标记的丙氨酸增加了近3倍,被标记的BCAAs(亮氨酸,缬氨酸,异亮氨酸)、丝氨酸和甘氨酸增加了近2倍。以上结果说明了,RPE/脉络膜的15N-胺基-谷氨酰胺的氨代谢途径比神经视网膜组织旺盛和复杂。2)进一步标记15N-酰胺基-谷氨酰胺结果显示:酰胺基在神经视网膜组织中,被标记谷氨酰胺浓度增加了 75倍,标记的天冬酰胺增加约2倍。在RPE/脉络膜中,被标记的谷氨酰胺增加了约60倍,天冬酰胺无变化。以上结果说明了,15N-酰胺基-谷氨酰胺氨代谢途径为再循环合成谷氨酰胺和天冬酰胺。但在RPE/脉络膜不能合成天冬酰胺。3)探究天冬氨酸氨代谢通路特点。15N-天冬氨酸追踪结果显示:神经视网膜中被标记的天冬酰胺增加了 5倍,谷氨酰胺和谷氨酸分别增加了 6倍和3倍。RPE/脉络膜组织中,标记的谷氨酰胺和谷氨酸分别增加了 3倍和3.5倍。此外,被标记的丙氨酸、丝氨酸和15N-甘氨酸增加大于2倍,但是天冬酰胺仍未被标记,浓度也无变化。以上结果说明了,天冬氨酸是神经视网膜组织合成谷氨酸,谷氨酰胺和天冬酰胺的主要原料,但是在RPE/脉络膜组织中天冬氨酸更多的是被用做来合成丙氨酸,丝氨酸和甘氨酸。4)探究丙氨酸氨代谢通路特点。15N-丙氨酸追踪结果显示:视网膜组织中被标记的仅有丙氨酸,增加接近20倍。RPE/脉络膜组织中,被标记的丙氨酸增加近40倍,同时天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸增加大于2倍,亮氨酸和丝氨酸增加近2倍。神经视网膜组织中谷氨酸/a-KG的比例是RPE/脉络膜组织的30倍,谷氨酸/丙氨酸的比例是RPE/脉络膜的4倍。说明RPE/脉络膜可以利用丙氨酸合成其他氨基酸。神经视网膜组织不能利用丙氨酸的含氮基团合成新的氨基酸,很可能是内源性谷氨酸/a-KG的比例过高,导致神经视网膜组织中丙氨酸氨基转移酶的催化是单一方向性。3、丙酮酸转运体(MPC)活性抑制后,主要氨基酸的氨代谢通路特点及机制:丙氨酸可以生成丙酮酸,丙酮酸是糖和氨基酸及脂肪代谢的枢纽。丙酮酸需要通过MPC进入线粒体氧化磷酸化。我们曾报道MPC被阻断后,天冬氨酸大量堆积。为了研究天冬氨酸来源,我们对最可能的两种来源氨基酸——谷氨酰胺和丙氨酸进行标记。1)MPC活性抑制后,谷氨酰胺氨代谢通路变化特点。15N-胺基-谷氨酰胺追踪结果显示:神经视网膜组织中,丙酮酸增加了 2.5倍,α-KG下降了约50倍,未标记天冬氨酸增加了 4.5倍,标记的天冬氨酸增加了 20倍。RPE/脉络膜中丙酮酸增加了 2.5倍,α-KG下降了约30倍,未标记的天冬氨酸增加了 4倍,标记的天冬氨酸增加了 20倍。均说明了谷氨酰胺的胺基是视网膜和RPE/脉络膜天冬氨酸的重要氮来源。2)MPC活性抑制后,丙氨酸氨代谢通路变化特点。15N-丙氨酸追踪结果显示:神经视网膜组织中,丙酮酸增加了接近2倍,α-KG下降了约30倍,未标记天冬氨酸增加近6倍但标记的天冬氨酸微弱增加(<2倍)。RPE/脉络膜中丙酮酸增加了 2.5倍,α-KG下降了约30倍,未标记的天冬氨酸增加了3倍,标记的天冬氨酸却降低了接近2倍。说明丙氨酸不是天冬氨酸的重要氮来源。但当MPC活性被抑制后,神经视网膜组织可能利用丙氨酸合成天冬氨酸。但RPE/脉络膜却没有此通路。为了证实这种假设,我们对丙氨酸碳代谢进行标记研究。3)MPC活性抑制后,丙氨酸碳代谢通路变化特点。13C-丙氨酸追踪结果显示:神经视网膜组织中,被标记的丙氨酸增加3倍。丙酮酸代谢通路上氨基酸的变化特点为,丙酮酸、乳酸、延胡索酸、天冬氨酸和苹果酸增加大于2.5倍,被标记的柠檬酸和α-KG下降了 2倍,琥珀酸下降了约0.2倍。在RPE/脉络膜中,标记的丙氨酸和丙酮酸增加接近2倍这与神经视网膜一致。但是,苹果酸与天冬氨酸的增加均小于神经视网膜组织。说明了在神经视网膜组织中,抑制MPC增加了柠檬酸上游代谢物含量但是降低了柠檬酸以及它下游代谢物含量。神经视网膜组织中未检测到未标记的柠檬酸但是标记的柠檬酸含量增加了 1500。RPE/脉络膜组织中,未标记的柠檬酸含量接近6000,是被标记柠檬酸接近含量的6倍。这些结果说明,当MPC被抑制后,部分丙氨酸可以进入视网膜线粒体以补偿丙酮酸的缺乏,但RPE/脉络膜中并无此通路。结论1、游离氨代谢特点:1)脑组织与神经视网膜组织游离氨代谢通路类似,主要通过谷氨酰胺通路代谢氨,部分通过合成天冬酰胺通路代谢氨。但脑组织氨代谢物更容易蓄积,这可能与脑组织容易氨中毒有关。2)肝脏游离氨代谢通路活跃,主要有尿素循环通路、谷氨酰胺通路以及部分从头合成谷氨酸通路。并且,尿素循环通路和谷氨酰胺通路代谢游离氨的能力大致相等。3)神经视网膜与RPE/脉络膜的游离氨代谢通路主要是合成谷氨酰胺。但是只有视网膜可以通过合成天冬酰胺通路代谢氨。RPE/脉络膜通过合成多种氨基酸代谢氨。2、微环境中视网膜和RPE/脉络膜的氨基酸氨代谢通路特点:1)视网膜和RPE/脉络膜中,谷氨酰胺的胺基和酰胺基代谢通路不同,且有明显的组织特异性。谷氨酰胺中胺基是谷氨酸和天冬氨酸的主要氮来源,酰基经再循环合成的主要是谷氨酰胺和天冬酰胺。RPE/脉络膜的胺基-谷氨酰胺的氨代谢途径比神经视网膜组织旺盛和复杂。且RPE/脉络膜中酰胺基-谷氨酰胺不能合成天冬酰胺。2)视网膜和RPE/脉络膜中,天冬氨酸氨代谢通路具有组织特异性。神经视网膜组织中天冬氨酸是合成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的主要氮来源。但是在RPE/脉络膜中却是丙氨酸,丝氨酸和甘氨酸的重要氮来源。3)视网膜和RPE/脉络膜中,丙氨酸氨代谢通路具有组织特异性。MPC功能正常时,神经视网膜组织不利用丙氨酸通路代谢氨,但是RPE/脉络膜组织可以利用丙氨酸合成氨基酸。MPC被阻断时,神经视网膜组织中丙氨酸通路激活,部分丙氨酸可直接进入线粒体,补偿丙酮酸不足,但是RPE/脉络膜中无此补充通路。综上所述:氨代谢具有显著组织特异性,神经视网膜和视网膜色素上皮细胞在氨代谢中表现不同。但同时,视网膜色素上皮细胞可能通过激活多种氨基酸的代谢来支持视网膜的代谢,维持神经视网膜组织与RPE/脉络膜组织间的共生平衡。