ROS或pH响应型多肽类材料自组装及其抗肿瘤性能研究

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癌症已经成为威胁人类生命的重大疾病之一。传统的癌症治疗手段包括手术、放疗以及化疗。而放/化疗在治疗过程中由于没有针对肿瘤的特异性,其对于机体的副作用尤为明显。近十年发展起来的多肽聚合物药物体系可以有效解决传统疗法的这一问题。由于实体肿瘤中血管壁间隙宽、结构不完整,并且缺乏有效的淋巴回流,大分子类物质对于实体肿瘤都具有较高的通透性以及滞留性,而且由于多肽聚合物这类纳米药物具有的丰富的可修饰性、更好的生物相容性和更长的血液循环时间,人们能够设计并合成出特异性富集在肿瘤部位的多肽聚合物类药物,实现对肿瘤细胞高效杀伤,并且显著降低毒副作用。针对化疗药物缺乏靶向性及生物相容性较差的问题,采用多肽-药物缀合物组装纳米粒子,实现药物精准递送和杀伤效果。将抗癌药物(喜树碱)通过ROS响应单元(缩硫酮)与具有生物活性的线粒体靶向肽(多肽序列:KLAKLAKKLAKLAK)相结合,通过抗癌药物的疏水性和多肽的亲水性在溶液中自组装成球。利用核磁共振氢谱、飞行时间质谱对合成的多肽-药物缀合物进行了结构验证和表征。然后通过动态激光散射仪(DLS)的粒径变化和透射电子显微镜(TEM)的形貌变化对多肽-药物缀合物的ROS响应组装解体进行了研究。通过流式细胞仪对ROS过表达的癌症细胞进行了筛选,进行一系列细胞共聚焦成像实验,验证材料在细胞中的靶向性及线粒体原位ROS响应组装解体。最终对多肽-药物缀合物进行药效评价,发现材料能导致癌症细胞ROS提升、破坏线粒体诱导细胞凋亡,并且具有比单纯抗癌药物更优抗癌疗效。多肽类纳米药物在实际的应用治疗当中仍存在着许多问题和缺陷,其中纳米颗粒对于实体瘤较差的穿透性就是待解决的重要问题之一。由于实体瘤周遭血管缺失造成了内部较高组织液压,这也使多肽纳米药物很难到达实体瘤较深层次,只能对血管周围的肿瘤细胞造成杀伤,这大大限制了纳米药物在实际肿瘤治疗过程中的治疗效率,肿瘤极易复发。近些年来,“活体自组装”策略通过肿瘤区域自组装形貌变化为解决这一问题带来了希望。这一策略是针对于实体瘤相对于正常组织特异性的生理环境,如微酸环境、ROS过表达、基质金属蛋白酶过表达等,通过设计针对肿瘤微环境条件进行响应的纳米药物,使纳米药物能在肿瘤原位发生组装。这一策略使递送到肿瘤区域的纳米材料在肿瘤原位发生形貌变化,而借助“原位自组装”这一形貌变化策略使纳米药物能够递送到肿瘤较深层次的同时,保持材料较高抗肿瘤能力是对实体瘤治疗的关键所在。针对纳米药物对于实体瘤渗透能力弱的问题,采用多肽聚合物活体自组装策略,实现实体瘤深层递送效果并在肿瘤内部组装杀伤肿瘤。用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和二硫苏糖醇(DTT)合成生物相容性较好的β-硫代酸酯聚合物,然后通过迈克尔加成反应在聚合物主链上修饰pH响应的多肽和穿膜肽,使多肽聚合物具有微酸响应性并具有溶酶体破膜能力。通过核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱对聚合物主链进行表征,通过飞行时间质谱对合成的多肽进行结构验证,再通过核磁共振氢谱对多肽聚合物结构进行表征。然后分别通过材料的粒径变化表征,通过动态激光散射仪(DLS)的粒径变化、非极性荧光探针的荧光强度变化和透射电子显微镜(TEM)的形貌变化对多肽聚合物的pH响应自组装进行了研究。最终对多肽聚合物进行药物评价,在细胞水平发现多肽聚合物是通过破坏线粒体诱导细胞凋亡,细胞毒性实验表明pH响应多肽聚合物在发生自组装后影响了对细胞的杀伤能力,具有抗癌的效果。在细胞和活体的水平上对多肽聚合物的穿透性和胞内自组装行为进行了验证。细胞实验更加直观的展现了pH响应多肽聚合物的入胞过程及胞内响应的自组装行为,活体实验充分说明了小分子对于实体瘤的穿透性效果。综上所述,本文首先设计了多肽-药物纳米材料,凭借多肽靶向性和生物相容性好的特征,实现线粒体靶向并诱发组装解体释放药物,达到纳米级浓度癌症治疗;然后设计合成多肽聚合物,材料能够在弱酸条件下发生响应并聚集组装;最后克服纳米材料对于实体瘤穿透力不足缺点,通过多肽聚合物pH响应自组装行为实现了纳米药物针对实体肿瘤的深层穿透以及高效杀伤,为药物递送设计提供更多的可能。
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