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目的建立稳定抑制mmTOR基因表达的小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞株,为探讨AKT/mTOR信号通路在ARMD发生中的作用提供细胞模型,观察mTOR基因沉默对相关蛋白的影响。方法根据鼠源mTOR基因mRNA序列,设计并构建3对shRNA干扰序列shl：AGTACTGTAGCACCTTGGG; sh2:TCTTCTCTCTGTAGTCCCG; sh3: TGACAAGGAGATAGAACGG,分别与质粒GIPZ-GFP+Puro载体连接,构建重组质粒(慢病毒载体质粒)。将慢病毒载体质粒与慢病毒包装质粒共转染NIH/3T3细胞以包装慢病毒,收集病毒上清感染NIH/3T3靶细胞,荧光显微镜观察评价感染效率。以嘌呤霉素预实验筛选出的嘌呤霉素浓度药筛,扩大培养后得到稳定细胞株。Trizol法提取RNA后,反转录出cDNA,应用Real-time PCR检测NIH/3T3细胞中mTOR在基因的表达；全蛋白提取法提取细胞蛋白并BCA法测定蛋白浓度,应用Western blot检测NIH/3T3细胞中mTOR在蛋白水平的表达,筛选出干扰效果最佳的shRNA序列。结果1、mTOR在小鼠成纤维细胞株NIH/3T3中的表达结果：PCR检测发现在184bp的位置出现了较亮条带,说明mmTOR基因表达量充足；条带产物单一未见杂带,说明引物特异性较好,无明显非特异性产物。Western blot蛋白水平检测结果显示mTOR蛋白灰度较深,产物单一。基因及蛋白水平检测结果均表明mTOR在小鼠成纤维细胞株NIH/3T3中的有较好的表达。2、荧光镜检评价慢病毒感染及嘌呤霉素药物筛选结果：感染NIH/3T3细胞3天后,荧光显微镜下观察感染效率,各组感染效率均达90%。加用嘌呤霉素筛选3-6天,待空白对照细胞均死亡,稳定细胞株建立形成。3、有效干扰片段的筛选结果：Real—time PCR校正结果,低MOI,sh1:0.687±0.131；sh2：0.682±0.079；sh3：0.547±0.066；阴性对照：0.996±0.036；空白对照：1.00。高MOI,shl：0.529±0.073；sh2：0.435±0.090；sh3：0.284±0.028；阴性对照：0.808±0.120；空白对照：1.00。将空白对照作为参照,在低MOI组中,shl、sh2和sh3的敲低效率分别为31.3%、31.8%和45.3%。在高MOI组中,shl、sh2和sh3的敲低效率分别为47.1%、56.5%和71.6%。Western blot检测各组NIH/3T3细胞mTOR基因的蛋白表达,shl、sh2和sh3mTOR基因的蛋白表达均有不同程度减低。结论本实验针对小鼠mTOR基因mRNA序列,设计了三条干扰靶点,并设置了一条阴性对照,排除转染序列本身对基因表达的干扰,成功构建了mTOR shRNA慢病毒表达载体。通过对干扰序列抑制基因表达的初步分析,筛选出了最有效的干扰片段sh3。同时,载体系统带有嘌呤霉素抗性基因,慢病毒质粒感染细胞后,用含有嘌呤霉素的培养基对感染细胞进行筛选,获得了稳定感染慢病毒载体的阳性克隆细胞株。本研究结果显示,我们构建的慢病毒RNA干扰载体对鼠NIH/3T3细胞具有较高的感染效率。RT-PCR和Westem blot检测证实mTOR基因的mRNA和蛋白水平在感染携带干扰靶点的慢病毒后显著降低,从而可以有效地沉默NIH/3T3细胞中的mTOR基因表达,这表明有效RNA干扰的靶点设计成功,为进一步研究mTOR基因在ARMD小鼠模型中的作用提供了可靠的细胞模型。