第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、鉴定、培养目的:体外分离、鉴定、培养BMSCs。方法:贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,利用倒置相差显微镜对细胞形态进行观察,同时流式细胞仪测定CD29 CD34 CD44 CD105及细胞周期。结果:⒈倒置相差显微镜下可见培养的大鼠骨髓间充质干细胞,原代培养细胞呈多角形,成集落生长趋势。传代细胞逐代伸展呈长梭形,排列具有方向性。⒉流式细胞仪检测结果显示,第4代BMSCs,CD29表达率为99.8%,CD44表达率为99.9%,CD105表达率为99.4%,而CD34表达率为1.1%,表明实验用的第4代BMSCs是纯化的细胞。⒊细胞周期检测结果显示,第4代BMSCs,G1期细胞为80.049%,S期为14.832%。说明大多数是处于静止期细胞,是一群未分化的非定向细胞。第二部分5-氮胞苷(5-Aza)体外诱导BMSCs向心肌样细胞分化目的:利用5-Aza体外诱导BMSCs向心肌样细胞的分化。方法:取第4代纯化BMSCs以含3、5、10、15、20μmol/l 5-氮胞苷的培养液分别诱导12、24、48h。诱导后第21天免疫荧光细胞化学技术鉴定α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白(desmin)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)。考虑5-Aza的细胞毒性,结合细胞存活情况,统计分析α-横纹肌肌动蛋白表达率,确立10 umol/L作用24小时为最佳诱导条件。采用最佳浓度10μmol/l,最佳作用时间24h进行实验。在第7、14、21、28天用免疫荧光细胞化学技术鉴定心肌细胞α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白(desmin)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)表达。结果:⒈根据细胞存活情况和免疫荧光细胞化学技术鉴定α-横纹肌肌动蛋白阳性表达率,确定最佳浓度为10μmol/l,最佳作用时间为24h。⒉5-Aza诱导后细胞体积及细胞核增大,伸出不同大小、不同方向的突起,类似于心肌样细胞生长。⒊在用10 umol/L作用24小时后,第7天进行免疫荧光细胞化学技术鉴定,未见有α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白(desmin)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)表达。14天少量细胞α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白(desmin)阳性表达,心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)阴性表达。21天表达α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白(desmin)的细胞数量增多,并可见少量细胞阳性表达心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)。28天α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白(desmin)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)阳性表达细胞数量进一步增多。第三部分流体切应力对5-Aza诱导BMSCs成心肌样细胞影响的初步研究目的:观察体外对5-Aza诱导BMSCs成心肌样细胞的影响。方法:取第4代生长活跃的BMSCs接种于载玻片上(硫酸过夜,表面涂多聚赖氨酸),用终浓度为10μmol/l 5-Aza诱导干预24h后,超净工作台内将载玻片置于平行平板流动腔中固定,利用加载装置,通过改变循环液的流量来改变剪切力的大小。分组:实验组流体切应力为5 dyne/cm2、15 dyne/cm2、25 dyne/cm2的力学刺激24h,对照组不接受力学刺激。力学加载干预后,倒置显微镜观察细胞形态的变化和排列方向的改变。21天免疫荧光细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的阳性表达率。干预7天后RT-PCR测定心肌发育相关基因Nkx2.5的表达。干预21天后RT-PCR测定cTnI的基因表达。结果:⒈力学加载干预后,细胞间隙增宽,形态变长,细胞沿流动腔长轴方向伸长,细胞排列接近平行于力的方向。⒉免疫荧光细胞化学技术鉴定结果显示,力学刺激干预后,心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的阳性表达率均增加,15 dyne/cm2的效果最明显。⒊RT-PCR结果显示,Nkx2.5、cTnI均阳性表达,但经过力学刺激后阳性条带更为明显,15 dyne/cm2的力学刺激效果最为明显,但是25 dyne/cm2的效果并没有随着力的增大而增强。结论:⒈大鼠骨髓中可以分离出骨髓间充质干细胞并且可以在体外传代培养。⒉5-Aza可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。⒊5-氮胞苷(5-Aza)可联合适当的流体切应力诱导BMSCs向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮胞苷(5-Aza)。