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研究背景:线粒体钙超载会增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,并伴随着增加非特异性内膜通透性的风险,使线粒体膜电位去极化,致使细胞凋亡或坏死,引起肌肉萎缩。本课题组前期研究发现,冬眠达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)的典型慢肌比目鱼肌在冬眠不同时期线粒体钙浓度没有发生显著变化,典型的快肌趾长伸肌在冬眠期间出现显著的钙超载现象,并且出眠时没有恢复至冬眠前水平,其他骨骼肌在冬眠不同时期的线粒体钙浓度变化规律及其调控机制尚未明了。单向转运体复合物是线粒体摄钙通道中最重要的复合物,线粒体钙单运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是复合物中的关键通道蛋白,可以顺化学梯度摄取钙离子。线粒体钙摄取蛋白1(mitochondrial calcium uptake,MICU1)和线粒体钙摄取蛋白2(mitochondrial calcium uptake,MICU2)是MCU的调控蛋白,调控机制受钙浓度影响。依赖亮氨酸拉链-EF-手型跨膜蛋白1(leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1,Letm1)是一种线粒体内膜蛋白,可以介导钙离子的排出,对线粒体钙的动态平衡起关键作用。本研究通过测定达乌尔黄鼠不同骨骼肌在不同时期的线粒体钙浓度变化及摄钙蛋白MCU、摄钙调控蛋白MICU1和MICU2,以及排钙蛋白Letm1的基因和蛋白水平表达探索线粒体钙浓度的变化规律及其调控机制。研究目的:1.通过检测达乌尔黄鼠不同骨骼肌在冬眠不同时期的线粒体钙浓度变化,探索达乌尔黄鼠不同骨骼肌在不同时期的线粒体钙浓度变化规律。2.通过测量达乌尔黄鼠不同骨骼肌在冬眠不同时期摄钙蛋白MCU、摄钙调控蛋白MICU1和MICU2,以及排钙蛋白Letm1的基因和蛋白水平表达,探索线粒体钙浓度变化的调控机制。研究方法:1.以夏季活跃组(summer active group,SA)、冬眠前组(pre-hibernation group,PRE)、浅冬眠组(early torpor group,ET)、深冬眠组(late torpor group,LT)、阵间觉醒组(interbout arousal group,IBA)及出眠组(post-hibernation group,POST)六组黄鼠的跖肌(plantaris longus,PL)、外侧腓肠肌(lateral gastrocnemius,LG)及半腱肌(semitendinosus,ST)为实验对象,采用单根肌纤维分离技术和激光共聚焦技术测定黄鼠不同时期不同骨骼肌线粒体钙浓度的变化。2.通过实时荧光定量PCR测定不同骨骼肌线粒体钙通道蛋白MCU、MICU1、MICU2和Letm1的基因水平变化。3.通过Western Blot测定不同骨骼肌线粒体钙通道蛋白MCU、MICU1和Letm1的蛋白水平变化。研究结果:1.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌的线粒体钙浓度变化与IBA组相比,浅冬眠组的黄鼠腓肠肌线粒体钙浓度下降了4.34%(P<0.05),其余各组无明显差异;黄鼠跖肌的线粒体钙浓度在IBA时期略有升高,但没有统计意义。在冬眠不同时期均没有显著差异;与PRE组和IBA组相比,黄鼠半腱肌的线粒体钙浓度在EL组分别升高了5.99%(P<0.01)和3.29%(P<0.01)。2.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌线粒体钙通道蛋白的基因和蛋白水平表达(1)腓肠肌m RNA相对表达量:与SA组相比,MCU m RNA在LT(70.06%,P<0.01),POST(91.53%,P<0.001)组均升高;IBA和ET时期MICU1(IBA(31.2%,P<0.05),ET(49.35%,P<0.01)),MICU2(IBA(55.97%,P<0.01),ET(66.05%,P<0.001)),Letm1(IBA(47.64%,P<0.05),ET无变化)m RNA表达均降低。与SA和PRE相比LT和POST时期MICU1,MICU2,Letm1 m RNA表达均不同程度升高。(2)腓肠肌蛋白表达水平:与SA组相比,IBA组MCU、MICU1和Letm1蛋白表达分别降低了44.69%(P<0.01),34.15%(P<0.001),52.8%(P<0.01),POST组不同程度的升高,但未出现显著差异。与PRE组相比,冬眠阵三组和出眠组MICU1(IBA(23%,P<0.05),ET(40.23%,P<0.001),LT(39.1%,P<0.001),POST(34.48%,P<0.001)),Letm1(IBA无变化,ET(30.66%,P<0.01),LT(25.78%,P<0.05),POST(23.72%,P<0.05))蛋白表达均出现不同程度的降低,与IBA组相比,Letm1在ET组(34.55%,P<0.01),LT组(29.97%,P<0.01),POST组(22.38%,P<0.01)均出现显著降低。(3)跖肌m RNA相对表达量:与SA和PRE组相比,IBA和ET时期MCU,MICU1,MICU2 m RNA表达均不同程度降低,Letm1 m RNA表达没有变化。与SA组相比,MCU、MICU2、Letm1 LT时期m RNA表达分别升高48.93%(P<0.05),107.8%(P<0.001),91.67%(P<0.05);POST组MCU(49.4%,P<0.05),MICU2(73.35%,P<0.01)m RNA表达显著升高,MICU1,Letm1 m RNA表达没有变化。(4)跖肌蛋白表达水平:与SA相比,IBA和ET时期MCU(IBA无变化,ET(39.58%,P<0.01)),MICU1(IBA(64.98%,P<0.05),ET(81.09%,P<0.05)),Letm1(IBA(65.70%,P<0.001),ET(70.13%,P<0.001))蛋白表达均出现不同程度的升高。(5)半腱肌m RNA相对表达量:与SA组相比,冬眠阵三组MCU(IBA(67.49%,P<0.001),ET(79.25%,P<0.001),LT(73.18%,P<0.001)),MICU1(IBA(56.63%,P<0.01),ET(66.80%,P<0.001),LT(33.20%,P<0.01)),Letm1(IBA(76.92%,P<0.001),ET(81.62%,P<0.001),LT(60.25%,P<0.001))m RNA表达均出现不同程度的降低。出眠组MCU、MICU1、MICU2 m RNA表达均恢复至夏季水平,Letm1相比于夏季组m RNA表达下降41.03%(P<0.001)。(6)半腱肌蛋白表达水平:与SA组相比,MCU蛋白表达在各个时期没有发生显著变化,MICU1蛋白表达在POST组升高了14.27%(P<0.05),Letm1在ET(32.47%,P<0.05),LT(47.69%,P<0.01),POST(44.06%,P<0.01)时期蛋白表达均不同程度升高。与IBA相比,MCU蛋白表达在ET和LT组分别升高了22.23%(P<0.05),23.52%(P<0.05)。研究结论:1.跖肌在冬眠期间未出现线粒体钙超载,腓肠肌和半腱肌在冬眠期间出现线粒体钙超载,但出眠时恢复夏季组水平,说明三种骨骼肌有良好的线粒体钙稳态,且跖肌的钙稳态维持能力强于腓肠肌和半腱肌。2.黄鼠腓肠肌在冬眠期排钙蛋白Letm1的蛋白低表达可能是线粒体钙浓度增加的原因之一;跖肌在冬眠阵期间摄钙蛋白和排钙蛋白的一致性表达,可能是维持线粒体钙稳态的机制;半腱肌在冬眠期摄钙蛋白MCU的高表达可能是线粒体钙水平增加的原因之一。