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铁是果树生长和发育过程重要的微量元素,是影响果实产量和品质的重要因素之一。影响铁离子吸收的环境因素很多,如pH、营养元素、激素等。其中pH是影响果树吸收铁离子的重要因素。为了维持果树体内铁离子的动态平衡,果树根系通过质膜H+-ATPase酶外泌质子使得根系周围酸化,将难溶态铁转化为可溶态,供根系直接吸收。质膜H+-ATPase酶除了外泌质子和产生跨膜电势梯度外,还能为离子的转运提供能量。因此,质膜型(PM)H+-ATPase酶在铁离子的吸收和动态平衡过程中起着重要的作用。植物缺铁响应的分子机理在模式植物中已经被研究清楚,但是对于多年生木本植物缺铁响应的分子机理尚不清楚。植物的Ib类和IVc类bHLH转录因子在铁离子的吸收过程中扮演者重要的角色。本研究从苹果中克隆到一个IVc类bHLH转录因子基因,命名为MdbHLH104, RT-PCR分析发现其表达受缺铁诱导。为了验证其功能,将35S::MdbHLH104过表达载体遗传转化并获得了苹果的转基因植株和愈伤组织;表型分析发现,在缺铁条件下,MdbHLH104转基因株系表现出明显抗缺铁能力,并且根际质子外泌和三价铁离子还原酶活性都增加,植物体内铁离子含量也比野生型对照高。进一步研究发现,MdbHLH104蛋白能够直接结合到MdAHA8基因(编码PMH+-ATPases)的和Ib类bHLH转录因子基因的启动子上,激活这些基因的表达,从而正调控PM H+-ATPases的酶活性和Ib类bHLH转录因子的转录能力。以MdbHLH104为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛选cDNA文库,得到一些与MdbHLH104互作的蛋白。酵母双杂交和Pull-Down分析的结果表明,MdbHLH104蛋白分别与MdPYE、MdILR3 (MdbHLH105)、MdbHLH115、MdbHLH11和MdbHLH121等其他IVc类bHLH转录因子相互作用,形成异源二聚体共同正调控下游基因MdAHA8的表达,分别共表达MdbHLH104与MdPYE、MdILR3 (MdbHLH105)、MdbHLH115、 MdbHLHll或MdbHLH121明显增强转基因苹果愈伤组织中的H+-ATPase活性和铁含量。此外,还筛选到了2个BTB/POZ-TAZ蛋白MdBTl和MdBT2,序列搜索比对发现,苹果基因组还编码另外三个BTB-TAZ蛋白,分别为MdBT3.1、MdBT3.2和MdBT4,结构域分析表明,5个MdBTs蛋白都含有三个保守的结构域,即N端的BTB/POZ结构域,中间位置的TAZ结构域和C端的钙调素结合结构域。酵母双杂交、Pull-Down和Co-IP(免疫共沉淀)分析试验表明,5个MdBTs蛋白中只有MdBTl和MdBT2能够与MdbHLH104相互作用,具体互作区域是MdBT1和MdBT2的TAZ结构域和MdbHLH104的C末端区域。Western杂交分析的结果显示,MdbHLH104蛋白在35S::MdBT1/2-Anti(反义沉默表达载体)转基因苹果愈伤组织中的积累水平高于,而在35S::MdBT2(正义过量表达载体)转基因苹果愈伤组织中的积累水平低于对照,表明MdBTs蛋白负调控MdbHLH104蛋白的丰度。深入研究表明,MdBT2蛋白能够与MdCUL3互作形成CRL3BT2E3泛素化连接酶复合体,离体和活体泛素化以及体外降解试验表明,CRL3BT2 E3泛素化连接酶复合体介导MdbHLH104蛋白的泛素化修饰,进而通过26S蛋白酶体途径降解,因此,MdBT2蛋白通过MdbHLH104调控植物体内质子外泌和铁离子的吸收及动态平衡。最后,我们还发现MdBT1和MdBT2蛋白的稳定性受铁离子的直接调控,即铁存在条件下促进MdBT1和MdBT2蛋白的积累,缺铁则抑制两个蛋白的积累。总之,本文阐述了一个缺铁逆境应答和调控途径:铁离子浓度H+-ATPase活性一逆境应答。