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研究背景在所有的男性恶性肿瘤中结直肠癌（colorectal cancer,CRC）排名世界第三,在女性恶性肿瘤中结直肠癌排名世界第二。据统计全球每年新增结直肠癌患者达1百多万,超过50万的患者因为结直肠癌而死亡。从全世界范围来看结直肠癌都是最常见的恶性肿瘤之一,但是到目前为止还缺乏有效的生物标志物诊断结直肠癌及用于结直肠癌后续治疗的评价。microRNA（miRNA）是一种抑制mRNA翻译并触发mRNA降解的单链小RNA。miRNA在结直肠癌中异常表达,并与其发生、发展及耐药性有关。大量研究表明miRNA可通过转录后调控靶基因的表达影响结直肠癌细胞的细胞周期、分化、凋亡及迁移。miR-31-5p在多种恶性肿瘤中发挥癌基因的作用,但miR-31-5p在结直肠癌发生发展中的作用却鲜见报道。因此本研究旨在探讨miR-31-5p在结直肠癌中的作用及其可能的分子机制,以期为结直肠癌的治疗提供新的作用靶点。研究目的越来越多的证据表明miRNA的异常表达有助于结直肠癌的发生和发展。miR-31-5p在多种肿瘤的发生发展过程中起着关键的作用,然而miR-31-5p在结直肠癌进展中的潜在作用及机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-31-5p对结直肠癌细胞增殖,侵袭,迁移,细胞周期及凋亡的影响及其特异性的作用机制。研究方法第一部分miR-31-5p在结直肠癌组织及结直肠癌细胞株中的表达及对结直肠癌细胞体内及体外生物学行为的影响1.qRT-PCR法检测miR-31-5p在结直肠癌组织,癌旁正常组织及结直肠癌细胞株中的相对表达,分析结直肠癌组织中miR-31-5p表达与患者临床特征的关系。2.转染miR-31-5p inhibitor抑制miR-31-5p的表达,qRT-PCR法检测miR-31-5p在HT29及HCT116细胞株中的相对表达,CCK-8检测结直肠癌细胞株增殖能力,流式细胞术评价细胞周期和细胞凋亡,Transwell实验检测结直肠癌细胞迁移及侵袭。3.在4-6周龄BALB/c小鼠皮下注射转染miR-31-5p inhibitor的HT29细胞,建立裸鼠移植瘤模型,计算肿瘤体积和质量,绘制生长曲线。第二部分miR-31-5p与NUMB的靶向关系研究1.通过生物信息学数据库miRBase（http://www.mirbase.org/）和TargetScanHuman（http://www.targetscan.org/vert71/）预测miR-31-5p的靶基因,通过荧光素酶报告基因法证实NUMB是miR-31-5p的靶基因。2.qRT-PCR及Western blotting法分析结直肠癌组织及癌旁正常组织中NUMB的表达,对miR-31-5p及NUMB表达的相关性进行分析。转染miR-31-5p mimic过表达miR-31-5p,检测结直肠癌细胞中NUMB mRNA及蛋白表达水平。3.在结直肠癌细胞中转染pcDNA3.0-NUMB质粒上调NUMB基因的表达,qRT-PCR法检测NUMB mRNA的表达水平,CCK-8检测结直肠癌细胞株增殖能力,流式细胞术评价细胞周期和细胞凋亡,Transwell实验检测结直肠癌细胞迁移及侵袭。4.为了证实miR-31-5p通过靶向NUMB调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,HT29和HCT116细胞被转染miR-31-5p inhibitor及miR-31-5p inhibitor+NUMB siRNA,qRT-PCR法检测NUMB mRNA的表达水平,CCK-8检测Blank组,NC组,miR-31-5p inhibitor组及miR-31-5p inhibitor+NUMB siRNA组结直肠癌细胞株增殖能力,流式细胞术评价各组细胞周期和细胞凋亡,Transwell实验检测各组结直肠癌细胞迁移及侵袭。第三部分miR-31-5p通过靶向NUMB调控Notch信号通路1.为了探讨miR-31-5p-NUMB轴调控结直肠癌增殖,迁移和侵袭的机制,我们用蛋白质与基因相互作用数据库BioGRID（http://thebiogrid.org/）预测可与NUMB相互作用的蛋白质,发现Notch1蛋白可与NUMB相互作用。2.在HT29和HCT116细胞中转染miR-31-5p inhibitor,检测结直肠癌细胞中NUMB及Notch1蛋白表达水平。3.在结直肠癌细胞中转染pcDNA3.0-NUMB质粒上调NUMB的表达,Western blotting法检测NUMB及Notch1的表达水平。4.为了证实miR-31-5p通过靶向NUMB调控Notch1的表达,HT29和HCT116细胞被转染miR-31-5p inhibitor及miR-31-5p inhibitor+NUMB siRNA,Western blotting法检测NUMB和Notch1蛋白的表达水平。5.将培养的HT29和HCT116细胞分成六组:Blank组,miR-31-5p inhibitor NC组,NUMB siRNA NC组,miR-31-5p inhibitor组,miR-31-5p inhibitor+NUMB siRNA组,miR-31-5p inhibitor+NUMB siRNA+Notch1siRNA组,Western blotting法检测NUMB和Notch1蛋白的表达水平。统计学分析GraphPad Prism 5.0软件被用于统计分析。两组数据之间用两独立样本t检验比较的它们之间的差异。Kruskal-Wallis检验用于比较三组或以上数据之间的差异。P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果第一部分1.我们使用qRT-PCR法检测了结直肠癌组织中miR-31-5p的表达,证实了miR-31-5p在结直肠癌组织中的表达水平高于配对正常组织。同时我们对不同结直肠癌细胞系中miR-31-5p的表达水平进行了检测,结果表明miR-31-5p在HT29细胞株中的表达水平最高。miR-31-5p表达水平与结直肠癌患者肿瘤大小（P=0.046）、肿瘤远处转移（P=0.0084）及TNM分期（P=0.0387）相关,但与年龄（P=0.7746）及性别（P=0.3121）无关。2.与阴性对照组及空白对照组相比,miR-31-5p inhbitor组miR-31-5p相对表达水平明显降低。通过miR-31-5p inhbitor下调miR-31-5p的表达可显著抑制HT29和HCT116细胞的增殖。并且miR-31-5p表达下调可诱导HT29和HCT116细胞凋亡及G1期阻滞,其中G1期细胞比例增加,S期细胞比例下降,Hoechst 33258染色法进一步证实了抑制miR-31-5p的表达可促进细胞凋亡。除此之外,miR-31-5p表达下调可抑制HT29和HCT116细胞的迁移和侵袭能力。3.为了在体内证实miR-31-5p的作用,我们用裸鼠成瘤实验评价miR-31-5p对HT-29细胞体内成瘤能力的影响,结果表明与对照组相比,miR-31-5p inhibitor组肿瘤质量及体积明显减小,肿瘤生长速度变慢。第二部分1.我们使用miRBase和TargetScanHuman预测了miR-31-5p的靶基因,发现NUMB基因的3′-UTR区域存在与miR-31-5p的潜在结合位点。为了证实我们的推测,我们构建了NUMB野生型及突变型荧光素酶报告质粒并进行了荧光素酶活性测定,结果表明miR-31-5p明显抑制了含有野生型NUMB报告基因的荧光素酶活性而不是突变型NUMB,这些数据证实NUMB是miR-31-5p直接作用的靶点。2.与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中NUMB的mRNA和蛋白表达明显降低,进一步的相关分析结果表明miR-31-5p和NUMB表达水平呈负相关。过表达miR-31-5p后NUMB的mRNA和蛋白表达也明显降低。3.为了研究NUMB在结直肠癌中的作用,我们在HT29和HCT116细胞中转染pcDNA3.0-NUMB质粒过表达NUMB,NUMB表达水平在转染pcDNA3.0-NUMB质粒的结直肠癌细胞中明显上调。过表达NUMB可明显抑制HT29和HCT116细胞的增殖。NUMB的过表达可导致HT29和HCT116细胞G1期阻滞,使得G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低。我们也发现过表达NUMB可抑制HT29和HCT116细胞的迁移和侵袭能力。不仅如此,过表达NUMB还可诱导结直肠癌细胞的凋亡。4.为了进一步研究miR-31-5p和NUMB在结直肠癌中的作用,我们用miR-31-5p inhibitor和NUMB siRNA单独或联合抑制miR-31-5p和NUMB的表达。在转染miR-31-5p inhibitor的HT29和HCT116细胞中NUMB的表达水平增高,但是NUMB siRNA可逆转其表达。与阴性对照组和空白对照组相比,miR-31-5p inhibitor可明显降低HT29和HCT116细胞的增殖能力,然而NUMB表达的下调则可增强HT29和HCT116细胞的增殖能力。细胞周期分析显示转染miR-31-5p inhibitor可诱导HT29和HCT116细胞G1期阻滞,而敲除NUMB可逆转miR-31-5p inhibitor的作用效果。并且在HT29和HCT116细胞中转染miR-31-5p inhibitor可明显抑制细胞的迁移和侵袭能力,而NUMB表达的下调可逆转其抑制效果。除此之外,敲除NUMB可逆转miR-31-5p inhibitor诱导的HT29和HCT116细胞的凋亡。我们的研究结果证实NUMB是miR-31-5p的功能性中介体,在结直肠癌的增殖、迁移和侵袭中起着关键作用。第三部分1.通过蛋白质与基因相互作用数据库BioGRID我们发现Notch1蛋白可与NUMB相互作用。Notch1蛋白是Notch信号通路的关键蛋白,因此我们推测miR-31-5p-NUMB诱导结直肠癌细胞增殖,迁移和侵袭与Notch信号通路相关。2.Western blotting结果显示HT29和HCT116细胞中miR-31-5p表达下调可降低Notch1的表达水平,相反下调miR-31-5p的表达可导致NUMB表达水平的增加。3.NUMB的过表达可抑制HT29和HCT116细胞中Notch1蛋白的表达。4.在转染miR-31-5p inhibitor的HT29和HCT116细胞中NUMB蛋白的表达水平增高,但是NUMB siRNA可逆转其表达。与阴性对照组和空白对照组相比,miR-31-5p inhibitor可抑制HT29和HCT116细胞中Notch1蛋白的表达,而NUMB表达的下调可逆转其抑制效果。5.NUMB和Notch1蛋白在Blank组,miR-31-5p inhibitor NC组和NUMB siRNA NC组中的表达无显著差异。与这3组相比,抑制miR-31-5p的表达可上调NUMB蛋白表达,降低Notch1蛋白的表达水平,但是NUMB siRNA可逆转NUMB的高表达及Notch1的低表达。不仅如此,Notch1 siRNA可再次逆转NUMB沉默所导致的Notch1蛋白的高表达。这些研究结果证实miR-31-5p通过靶向NUMB调控Notch信号通路。结论1.miR-31-5p在结直肠癌组织中的表达水平高于配对正常组织,其与结直肠癌患者肿瘤大小、肿瘤远处转移及TNM分期相关。2.下调miR-31-5p表达可抑制结直肠癌细胞的增殖,侵袭和迁移能力,诱导结直肠癌细胞凋亡及G1期阻滞。3.体内实验证实下调miR-31-5p表达可使裸鼠移植瘤质量及体积减小,肿瘤生长速度变慢。4.NUMB是miR-31-5p的靶基因,miR-31-5p通过抑制NUMB促进结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭。5.miR-31-5p通过靶向NUMB调控Notch信号通路促进结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭。