论文部分内容阅读
自荧光蛋白问世以来,研究人员已从生物体内分离出多种荧光蛋白及在此基础上利用分子生物学技术进化出几乎覆盖整个荧光光谱的突变体,并广泛应用到分子生物学,细胞生物学,生物医学等各个领域。同时,荧光蛋白的研究与荧光显微技术、流式细胞术等技术相结合产生诸如FRET(荧光能量共振转移技术),BiFC(双分子荧光互补技术),光漂白技术,荧光蛋白标签,荧光蛋白传感器,荧光计时器等新技术,使荧光蛋白成为生物学研究领域中不可或缺的工具之一。
本研究采用噬菌体Mu转座子突变系统将外源基因随机插入到荧光蛋白mCherry中,然后利用流式细胞分选技术,成功筛选出13个mCherry突变体。流式筛选得到的13个突变体其外源短肽插入位置不同,分别位于mCherry氨基酸序列的第K9,E10,F11,F65,G90,G116,K121,E148,M150,L157,G171,V187,T223氨基酸残基位置处,分别命名为m9,m10,m11,m65,m90,m116,m121,m148,m150,m157,m171,m187,m223。这些mCherry突变体经波长为587nm激发光照射,仍然发出较弱的红色荧光,但荧光强度各异。mCherry突变体中短肽插入位点分布不同,导致其荧光强度相差甚大。其中插入位点在蛋白C-/N-端附近的突变体如m9,m10,m11,m223荧光强度最亮;插入位点分布在荧光蛋白Loop结构内的突变体如m90,m116,m171,m187荧光较亮;分布在β-折叠柱上的突变体m121,m148,m150,m157荧光强度最小。尤其值得关注的是,位于发色基团临近的m65突变体荧光强度较强,约为野生型mCherry荧光的52%。
本研究筛选得到的mCherry突变体中外源短肽插入位点共有13处,为下一步改造mCherry插入更长片段提供了有价值的插入位点,是最终在mCherry中插入敏感功能域进而构建mCherry荧光蛋白传感器的重要基础。