近年来,对目的基因进行靶向修饰,逐渐成为研究基因功能,制作疾病模型以及家畜遗传改良领域的热点。作为传统基因打靶技术的替代者之一,锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)逐渐走进研究人员的视野。ZFNs由识别DNA的锌指蛋白和负责DNA切割的Fok I核酸酶组成,可以定向诱导靶基因位点出现双链断裂,从而启动细胞内“非同源重组末端连接”(NHEJ)的应急修复机制,导致断裂位点发生碱基的插入、缺失或突变,进而造成基因失活。在本研究中,我们利用设计构建的一对锌指核酸酶,针对小鼠MSTN基因进行了定点敲除,并最终获得基因纯合突变的小鼠。1、为了获得用于小鼠胚胎干细胞最佳的双质粒转染条件,用EcoRI和CpoI分别对pDsRed2-1 和 pIRES2-EGFP进行双酶切,回收目的片段进行连接,得到红色荧光蛋白表达质粒pRFP-N1。将其与绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1混合,按照不同的Lipofectamine LTX使用量以及质粒使用量来设定转染组合参数,对R1小鼠胚胎干细胞进行双质粒转染参数的优化。转染36小时后,绝大多数的转染组合参数,均可在倒置荧光显微镜下观察到同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的干细胞克隆存在,说明脂质体Lipofectamine LTX可以介导R1 mES细胞的双质粒转染,且外源基因可以得到表达。进一步用流式细胞仪分析发现,在12孔板中加入2×105个细胞的条件下,每孔使用4μL Lipofectamine LTX,分别加入500ng pEGFP-C1和pRFP-N1质粒时,获得了最高为26.9%的双转染效率。2、本研究使用的ZFNs的识别和切割位点位于小鼠MSTN基因第一外显子区域。每一个ZFN均识别18bp的基因组DNA序列,其间有6bp的间隔区域,切割结构域Fok I被设计成异源二聚体形式以提高其特异性。将成对的锌指核酸酶质粒按照优化好的条件对R1mES细胞进行转染,共挑取768个单细胞进行培养,形成148个细胞单克隆,共获得了8株在ZFNs切割位点发生单等位基因突变的克隆,1株双等位基因突变的克隆,总敲除效率达到6.08%。选取单等位基因突变的克隆1-3号,进行ZFNs的二次转染,获得了两株双等位基因突变的克隆(D02, D08)。对1-3和D02两株MSTN基因突变干细胞克隆的碱性磷酸酶和免疫细胞化学的染色结果显示,两株细胞克隆均为碱性磷酸酶阳性,Oct-3/4、Sox-2, SSEA-1也均为表达阳性,而SSEA-4则没有表达,这说明这两株细胞克隆依然保持了胚胎干细胞的非分化特性。通过囊胚腔注射分别得到了1-3和D02两株细胞的嵌合体后代,对基因突变位点PCR产物的测序结果显示,嵌合体后代携带有与注射细胞相同的突变模式。3、利用体外转录获得ZFNs mRN A,通过对FVB品系小鼠受精卵的胞质内显微注射,出生28只小鼠,经检测确定,其中4只原代小鼠(M4, M7, M8 和 M24) MSTN基因发生了突变,其中M8号小鼠目标切割位点存在三种基因型,除野生型外,还存在两种不同的突变型,即这只小鼠是嵌合体。将得到的4只原代小鼠进行纯合繁育,其中M4,M7号小鼠均得到与其突变型一致的纯合子后代,M8号分别得到两种突变型的纯合子后代,M24号未能得到后代。对于其幼崽的出生率的统计结果发现,MSTN基因纯合敲除会导致幼崽出生数显著减少。对于10周龄MSTN基因纯合敲除雄性小鼠进行体重测量,结果显示MSTN基因纯合敲除小鼠的平均体重显著高于同周龄的野生型小鼠。并且其肌肉量与野生型小鼠相比也出现了显著的增加。Western blot的结果显示,在来源于M8号小鼠的两种纯合子后代中,几乎检测不到MSTN蛋白的表达。通过Real-time PCR技术进行相对定量分析的结果表明,MSTN基因纯合敲除会引起肌肉发育相关基因的mRNA表达量发生不同程度的变化。