论文部分内容阅读
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一,在全世界范围内感染HCV的数据是1.7亿。70–80%的丙肝病毒感染是持久感染并且这其中30%的持久感染患者最终将发展成为慢性肝脏疾病,包括肝硬化,肝细胞癌等。全世界每年约有250,000～350,000人死于HCV相关终末期肝病、肝硬化及肝癌,对患者的健康和生命危害极大,早已成为严重的社会与公共卫生方面的问题,但目前我们针对HCV感染的治疗手段十分有限,目前主要的治疗手段是干扰素加利巴韦林,但是效果不佳,而且不能用于肝硬化失代偿期的患者。更令人遗憾的是,迄今为止,还没有任何一个国家研究出可预防HCV感染的疫苗[1-3]。所以,进一步深入揭示HCV的发病机制,探寻HCV致病的分子生物学机制也便成为当今研究的热点问题之一。丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein 6)是本课题组前期实验中应用酵母双杂交技术从肝细胞cDNA文库中筛选得到的一种可以与丙型肝炎病毒核心蛋白相结合的蛋白[4]。前期研究发现,HCBP6蛋白能够上调和下调一系列不同基因的表达水平,这些差异表达的基因与细胞信号的转导、增生、分化及生长调节密切相关。因此,对HCBP6进行更深一步的研究是十分必要的。前期,我们从转录水平的调节入手对HCBP6进行了研究,应用相关的生物信息学技术对HCBP6基因启动子上转录因子的结合位点进行了预测,并通过缺失等方法进一步验证该启动子活性区域的存在,还用EMSA(凝胶迁移率实验)对该活性区域以及与该区域结合的转录因子进行验证。现在我们分别构建HCBP6过表达和RNAi载体并且经过筛选得到抑制效率高的RNAi载体,通过划痕试验来初步证明HCBP6可能有的功能。目的本课题旨在研究HCBP6蛋白在肝癌细胞系HepG2增殖过程中发挥的作用,分别从构建过表达载体和RNAi载体两个方面来证明HCBP6蛋白在HepG2细胞中可能具有的功能,给后续的功能学实验做一个探索。方法1、成功构建过表达载体,在该载体上加入c-myc和His标签为后续蛋白纯化及筛选识别实验做准备2、构建RNAi载体,通过荧光显微镜来初步判定转染效率,并且提取转染后细胞的总RNA,逆转录为cDNA做Real Time PCR来检测并筛选出抑制效率高的两个RNAi质粒。3、通过初步的功能学实验来初步验证HCBP6对于真核肝癌细胞HepG2迁移速率的影响,判断该基因对于肝癌细胞HepG2迁移,即对肿瘤细胞的转移的影响。结果1.成功获得了HCBP6的过表达载体pcDNA3.1/myc-his(-)-HCBP6。2.成功获得HCBP6的含有绿色荧光蛋白的RNAi载体,且测序证实插入序列与理论序列一致。试验组的表达活性与对照组的表达活性相比降低0.6倍。获得了具有较高抑制效率的含有HCBP6基因序列的质粒。3.本实验组HepG2细胞在经划痕试验检测后得到:HCBP6可以促进细胞的迁移。在0-6h每小时迁移13微米,在6-12h每小时迁移7微米,12-24h每小时迁移13微米,而阴性荧光对照组0-6h每小时迁移12微米,6-12h每小时迁移5微米,12-24h每小时迁移13微米,由此获得实验组细胞迁移速率与对照组相比有加快趋势。从而初步证明HCBP6基因对于肝癌细胞HepG2迁移,即对肿瘤细胞的转移可能有影响。结论1.构建pcDNA3.1/myc-his(-)-HCBP6过表达载体。2.成功构建HCBP6的干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-HCBP6。3.HCBP6对于肝癌细胞HepG2可能具有促进细胞迁移的作用,对HCBP6功能学方面研究进行了初步探索