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Rab蛋白属于小G蛋白(small GTPase)超家族的一个亚家族,在细胞内膜运输等生理过程中起着重要的作用。近年来在果蝇和虾等无脊椎动物中的研究表明一些Rab蛋白参与了吞噬作用等细胞免疫反应。本课题组在分析棉铃虫(Helicoverpa armigera)的血细胞转录组时鉴定到一个Rab基因一Rab3,命名为Ha-Rab3。Rab3在突触囊泡的运输过程中起着重要的作用。最近在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中的一项研究表明Rab3可能也参与先天免疫反应的调控。本试验运用了RNAi等方法研究了Ha-Rab3基因在棉铃虫先天免疫中的功能。实验结果如下：1、棉铃虫Ha-Rab3基因的克隆及序列分析从棉铃虫血细胞中克隆到Ha-Rab3基因的全长序列。该序列长678bp,其开放阅读框长657bp,编码218个氨基酸残基。序列比对发现Rab3在不同物种中高度保守,Ha-Rab3与家蚕(Bombyx mori) Rab3相似性最高,达到96%,与哺乳动物小鼠(Mus musculus) Rab3C的相似性也高达81%。结构域预测表明该蛋白无信号肽序列,含有一个Rab结构域(20-183aa)。2、Ha-Rab3基因组织特异表达分析利用半定量RT-PCR分析Ha-Rab3基因在棉铃虫不同组织中的表达情况,结果显示Ha-Rab3基因在脂肪体、血细胞、中肠和表皮中均有表达。3、免疫刺激后棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因的表达量显著上调利用荧光定量PCR技术检测了注射大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和凝胶珠后棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因表达量的变化,结果显示：细菌和凝胶珠的免疫刺激均能显著上调血细胞中Ha-Rab3基因的表达量。这项研究结果表明Ha-Rab3基因可能参与了棉铃虫免疫反应的调控。4、注射dsRNAHa-Rab3能显著敲降棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因的表达利用荧光定量PCR技术检测了注射dsRNAHa-Rab348h后棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因表达量的变化,结果显示：当dsRNAHa-Rab3的注射量为3μg/只时就能产生干扰效果,但当注射量达到6μg/只时,敲降效果非常显著。这表明注射dsRNAHa-Rab3能显著敲降Ha-Rab3基因的表达,且敲降呈现出一种剂量依赖效应。5、RNAi敲降血细胞中Ha-Rab3基因的表达后血细胞的吞噬能力显著降低体外吞噬分析显示,将棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因敲降后,棉铃虫血细胞对大肠杆菌的吞噬率及吞噬指数均显著性下降。这一结果表明Ha-Rab3基因可能参与了棉铃虫血细胞吞噬反应的调控。6、RNAi敲降血细胞中Ha-Rab3基因的表达后棉铃虫清除血淋巴中细菌的能力显著降低细菌清除实验显示,将棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因敲降后,棉铃虫清除血淋巴中细菌的能力显著降低。这一结果进一步证实Ha-Rab3基因在棉铃虫的先天免疫中起着重要的作用。7、RNAi敲降血细胞中Ha-Rab3基因的表达后棉铃虫血细胞延展能力显著下降将Ha-Rab3基因敲降后,棉铃虫浆细胞的延展率出现了明显的下降,表明Ha-Rab3基因可能参与了棉铃虫血细胞延展行为的调控。8、RNAi敲降血细胞中Ha-Rab3基因的表达后血细胞的包囊能力显著降低将棉铃虫血细胞中Ha-Rab3基因敲降后,棉铃虫血细胞对凝胶珠的包囊能力显著下降,表明Ha-Rab3基因可能参与了棉铃虫血细胞包囊作用的调控。综上所述,本文克隆了棉铃虫Ha-Rab3基因并研究了这一基因在棉铃虫先天免疫中的作用。结果表明Ha-Rab3基因在棉铃虫吞噬作用和包囊作用等细胞免疫反应中起着重要的作用。实验结果还初步揭示了Ha-Rab3基因作用的机理,即Ha-Rab3基因可能通过介导血细胞的延展行为来调控棉铃虫的细胞免疫反应。