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目的：念珠菌是最常见的人类真菌病原体，既可引起皮肤和粘膜的浅表感染，也可诱发全身感染，严重影响患者生活质量，甚至危及生命。现有抗真菌药物作用机制单一，长期使用引起耐药激增，多途径治疗念珠病的临床需求日益提高。现代研究表明乌拉草具有良好抑菌活性，其抑菌产品应用广泛，但其抑菌活性物质及作用机制研究匮乏。本研究通过开展乌拉草抑制白色念珠菌活性生物导向分离，筛选抑菌活性组分，并开展活性组分抑制白色念珠菌的作用机制、体内外活性、作用靶点研究，挖掘乌拉草抗白色念珠菌主要活性物质及作用机理，为乌拉草药用资源开发、抗菌制剂成型相关研究提供支撑。
方法：1.考察乌拉草70%乙醇提取物（CM-70）对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌活性；采用大孔树脂柱层析分离CM-70提取物，筛选抗白色念珠菌活性组分，并初步分析该组分成分；采用硅胶柱层析分离CM-D90组分，筛选抑制白色念珠菌主要活性组分。
2.通过测定活性组分90%乙醇洗脱组分（CM-D90）作用于白色念珠菌最低抑菌浓度、生长曲线，考察其对白色念珠菌生长、增殖影响。通过测定胞外蛋白、麦角甾醇含量，比较黏附作用、芽管生成、胞外磷脂酶分泌，测定最低抑制生物膜浓度、观察生物膜细胞形态，分别考察CM-D90组分对白色念珠菌细胞膜、毒力因子以及生物膜细胞的影响，进而明确该组分抑制白色念珠菌体外活性及作用机制。随后考察硅胶分离活性组分对胞外蛋白含量、芽管生长、生物膜形成的影响，进一步筛选改变白色念珠菌细胞通透性、抑制菌丝生长、破坏生物膜作用机制的主要活性物质。
3.分别构建小鼠口腔念珠病、系统性念珠病模型，考察CM-D90组分、G-20组分干预后小鼠生存及感染情况、靶器官损伤及菌丝定植状态、血清细胞因子水平，明确该组分抑制白色念珠菌体内活性及作用机制。
4.分析并初步鉴定G-20组分成分，并通过Label-free蛋白质组定量分析该组分处理前后白色念珠菌蛋白质差异，根据差异蛋白功能，明确G-20组分抑制白色念珠菌生存、增殖及菌丝形成的通路和靶点。采用扫描电镜观察验证G-20组分处理后白色念珠菌菌丝抑制情况。采用qrt-PCR技术考察G-20组分对白念珠菌菌丝形成相关基因表达的影响。开展非同源蛋白分析，采用分子对接比较G-20组分中主要成分与菌丝形成关键蛋白结合能力，分析最佳结合成分与靶蛋白结合模式。
结果：1.乌拉草CM-70提取物作用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为125、125、500、62.5μg/mL。筛选发现大孔树脂分离组分中CM-D90具有显著抑制白色念珠菌的活性，并推测指认出该组分中脂肪酸、黄酮等类的94个化合物。通过凝胶柱层析共从CM-D90组分分离获得57个组分，其中45个组分具有抑制白色念珠菌活性，筛选并确定G-20、G-32、G-46、G-51组分为主要抑菌活性组分。
2.作用机制研究表明，CM-D90组分能够抑制白色念珠菌生长，并对24 h内增殖产生抑制；能够抑制麦角甾醇的生物合成（≥31.25μg/mL）破坏细胞膜结构、改变细胞通透性引起胞内蛋白泄漏（≥62.5μg/mL）；能够抑制白色念珠菌粘附性、芽管生长（≥62.5μg/mL）等毒力因子，并使白色念珠菌致密网状的生物膜结构变得松散，从而抑制生物膜细胞（SMIC50为125μg/mL）。进一步分析主要活性组分机制发现， G-51组分改变细胞通透性作用最强，G-20组分抑制芽管生成作用最为显著，且抑制生物膜能力最强（SMIC50为15.625μg/mL）。G-20组分为CM-D90组分抑制菌丝形成的主要活性组分。
3.体内活性研究表明，浓度为65、130、260 mg/Kg的CM-D90组分干预口腔念珠病小鼠后，其舌背伪膜面积减小、菌丝定植降低，口腔内菌量减少，舌乳头损伤被修复，小鼠脾脏萎缩得到控制；而干预系统性念珠病小鼠后，其体重恢复，肾脏累积菌量降低、菌丝定植减少、结构恢复，炎性细胞侵润降低。32.5、65、130 mg/Kg的G-20组分能够抑制小鼠口腔、系统白色念珠菌感染，清除靶器官菌落，缓解菌丝侵入，修复靶器官损伤，减少炎症细胞浸润。CM-D90组分、G-20组分治疗后两模型的小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17和IL-22等细胞因子水平均显著低于模型组，降低体内炎症介质残留，缓解炎症损伤。
3. Label-free蛋白质组定量分析发现G-20组分处理后白色念珠菌的354个蛋白表达存在差异，差异蛋白功能显示G-20组分通过影响核糖体合成、叶酸循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢等途径抑制白色念珠菌生长、增殖，通过环磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）途径影响白色念珠菌菌丝形成。经扫描电镜观察G-20组分处理后白色念珠菌菌丝形成受到极显著抑制，该组分为乌拉草抑制白色念珠菌毒力因子的主要活性组分。经qrt-PCR技术验证了G-20组分通过下调Asr2、Efg1、Sun41、Sec2的表达，影响菌丝形成及伸长，从而抑制菌丝生长。G-20组分主要成分与成药性较好的菌丝形成相关蛋白Efg1、Sun41、Sec2能够不同程度结合，热点残基具有相似性，呈现协同互补共同调控的特点，其中靛玉红、染料木素、α-亚麻酸、亚麻酸乙酯、亚油酸等具有潜在阻断活性。
结论：本研究表明乌拉草提取物具有良好的体内外抗白色念珠菌活性，G-20组分为其主要活性组分。该组分主要包含脂肪酸、黄酮、生物碱等成分，可以通过抑制核糖体合成影响翻译过程，通过叶酸循环途径抑制核苷酸合成影响DNA复制，并引起氨基酸代谢异常，抑制白色念珠菌生存及增殖；该组分可以通过阻断Efg1对菌丝特异蛋白启动和抑制菌丝特异蛋白Sun41、Sec2的表达，抑制菌丝形成及伸长，降低致病性。本研究挖掘乌拉草抑菌活性物质及作用机制，初步筛选出乌拉草可用于治疗口腔、系统性念珠病的成药靶点，为乌拉草抗真菌制剂开发提供研究基础，为乌拉草综合利用开发提供依据。
方法：1.考察乌拉草70%乙醇提取物（CM-70）对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌活性；采用大孔树脂柱层析分离CM-70提取物，筛选抗白色念珠菌活性组分，并初步分析该组分成分；采用硅胶柱层析分离CM-D90组分，筛选抑制白色念珠菌主要活性组分。
2.通过测定活性组分90%乙醇洗脱组分（CM-D90）作用于白色念珠菌最低抑菌浓度、生长曲线，考察其对白色念珠菌生长、增殖影响。通过测定胞外蛋白、麦角甾醇含量，比较黏附作用、芽管生成、胞外磷脂酶分泌，测定最低抑制生物膜浓度、观察生物膜细胞形态，分别考察CM-D90组分对白色念珠菌细胞膜、毒力因子以及生物膜细胞的影响，进而明确该组分抑制白色念珠菌体外活性及作用机制。随后考察硅胶分离活性组分对胞外蛋白含量、芽管生长、生物膜形成的影响，进一步筛选改变白色念珠菌细胞通透性、抑制菌丝生长、破坏生物膜作用机制的主要活性物质。
3.分别构建小鼠口腔念珠病、系统性念珠病模型，考察CM-D90组分、G-20组分干预后小鼠生存及感染情况、靶器官损伤及菌丝定植状态、血清细胞因子水平，明确该组分抑制白色念珠菌体内活性及作用机制。
4.分析并初步鉴定G-20组分成分，并通过Label-free蛋白质组定量分析该组分处理前后白色念珠菌蛋白质差异，根据差异蛋白功能，明确G-20组分抑制白色念珠菌生存、增殖及菌丝形成的通路和靶点。采用扫描电镜观察验证G-20组分处理后白色念珠菌菌丝抑制情况。采用qrt-PCR技术考察G-20组分对白念珠菌菌丝形成相关基因表达的影响。开展非同源蛋白分析，采用分子对接比较G-20组分中主要成分与菌丝形成关键蛋白结合能力，分析最佳结合成分与靶蛋白结合模式。
结果：1.乌拉草CM-70提取物作用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为125、125、500、62.5μg/mL。筛选发现大孔树脂分离组分中CM-D90具有显著抑制白色念珠菌的活性，并推测指认出该组分中脂肪酸、黄酮等类的94个化合物。通过凝胶柱层析共从CM-D90组分分离获得57个组分，其中45个组分具有抑制白色念珠菌活性，筛选并确定G-20、G-32、G-46、G-51组分为主要抑菌活性组分。
2.作用机制研究表明，CM-D90组分能够抑制白色念珠菌生长，并对24 h内增殖产生抑制；能够抑制麦角甾醇的生物合成（≥31.25μg/mL）破坏细胞膜结构、改变细胞通透性引起胞内蛋白泄漏（≥62.5μg/mL）；能够抑制白色念珠菌粘附性、芽管生长（≥62.5μg/mL）等毒力因子，并使白色念珠菌致密网状的生物膜结构变得松散，从而抑制生物膜细胞（SMIC50为125μg/mL）。进一步分析主要活性组分机制发现， G-51组分改变细胞通透性作用最强，G-20组分抑制芽管生成作用最为显著，且抑制生物膜能力最强（SMIC50为15.625μg/mL）。G-20组分为CM-D90组分抑制菌丝形成的主要活性组分。
3.体内活性研究表明，浓度为65、130、260 mg/Kg的CM-D90组分干预口腔念珠病小鼠后，其舌背伪膜面积减小、菌丝定植降低，口腔内菌量减少，舌乳头损伤被修复，小鼠脾脏萎缩得到控制；而干预系统性念珠病小鼠后，其体重恢复，肾脏累积菌量降低、菌丝定植减少、结构恢复，炎性细胞侵润降低。32.5、65、130 mg/Kg的G-20组分能够抑制小鼠口腔、系统白色念珠菌感染，清除靶器官菌落，缓解菌丝侵入，修复靶器官损伤，减少炎症细胞浸润。CM-D90组分、G-20组分治疗后两模型的小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17和IL-22等细胞因子水平均显著低于模型组，降低体内炎症介质残留，缓解炎症损伤。
3. Label-free蛋白质组定量分析发现G-20组分处理后白色念珠菌的354个蛋白表达存在差异，差异蛋白功能显示G-20组分通过影响核糖体合成、叶酸循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢等途径抑制白色念珠菌生长、增殖，通过环磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）途径影响白色念珠菌菌丝形成。经扫描电镜观察G-20组分处理后白色念珠菌菌丝形成受到极显著抑制，该组分为乌拉草抑制白色念珠菌毒力因子的主要活性组分。经qrt-PCR技术验证了G-20组分通过下调Asr2、Efg1、Sun41、Sec2的表达，影响菌丝形成及伸长，从而抑制菌丝生长。G-20组分主要成分与成药性较好的菌丝形成相关蛋白Efg1、Sun41、Sec2能够不同程度结合，热点残基具有相似性，呈现协同互补共同调控的特点，其中靛玉红、染料木素、α-亚麻酸、亚麻酸乙酯、亚油酸等具有潜在阻断活性。
结论：本研究表明乌拉草提取物具有良好的体内外抗白色念珠菌活性，G-20组分为其主要活性组分。该组分主要包含脂肪酸、黄酮、生物碱等成分，可以通过抑制核糖体合成影响翻译过程，通过叶酸循环途径抑制核苷酸合成影响DNA复制，并引起氨基酸代谢异常，抑制白色念珠菌生存及增殖；该组分可以通过阻断Efg1对菌丝特异蛋白启动和抑制菌丝特异蛋白Sun41、Sec2的表达，抑制菌丝形成及伸长，降低致病性。本研究挖掘乌拉草抑菌活性物质及作用机制，初步筛选出乌拉草可用于治疗口腔、系统性念珠病的成药靶点，为乌拉草抗真菌制剂开发提供研究基础，为乌拉草综合利用开发提供依据。