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[目的]
人口老龄化报告指出,全球大多数国家已经进入老龄化社会,我国是世界人口最多的国家,也是老年人口最多的国家,且老年化进程极快.现代衰老理论认为,机体衰老是一个缓慢且极为复杂的过程,组织细胞在形态结构和生理功能等方面逐渐出现衰退变化为其主要表现,随着细胞衰老进程的不断推进,必将出现各种老年性疾病.衰老生物学与防治老年性疾病的研究已成为当今生命科学与社会科学共同关注的重要课题.因此,加快推动衰老生物学与防治老年性疾病的研究已经迫在眉睫.
干细胞是指具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,干细胞已经成为现代生命科学领域中最受关注的研究领域之一.现代衰老理论认为,机体所有衰老现象,包括组织器官的退变、功能丧失、肿瘤发生、老年痴呆和反复感染等老年性疾病都反映出成体干细胞衰老水平.干细胞衰老学说是目前阐释机体衰老的最新理论,该学说认为,生物体衰老实际上是自身的干细胞衰老.
血液与造血系统是人体生命活动的源泉.造血干细胞在特定造血微环境的诱导下增殖分化为各系造血祖细胞,造血祖细胞进一步增殖分化形成形态学上可以识别的造血前体细胞,造血前体细胞再逐渐增殖分化形成成熟血细胞,并将其释放到外周血,以维持血细胞数量、比例的动态衡定.在机体衰老早期,尽管外周血成熟血细胞的数量得以维持,但随着衰老进程的推移,造血干细胞数量和功能会逐渐衰退.研究证明,随年龄增长造血干细胞会出现衰老的生物学表现,进而逐渐发生造血功能衰退,甚至出现造血干细胞分化异常而导致白血病的发生.深入探讨造血干细胞衰老机制,寻找延缓其衰老途径至关重要,课题组前期研究证明,小鼠造血干细胞随年龄增加会发生衰老变化,从而导致造血功能衰退.人类造血干细胞是否也会随时间进程发生衰老呢?如何选择延缓造血干细胞衰老的最佳干预时间?这是值得深入研究的课题.
本课题组长期致力于调控干细胞衰老相关研究.目前,已经从人参和当归等天然中药有效成分中寻找到抗衰老有效成分,并通过小鼠体内与体外研究证明,这些抗衰老成分有拮抗致衰剂诱导造血干细胞衰老的作用.人体造血干细胞衰老的时间动态生物学研究远比小鼠困难得多,且迄今未见相关报道.现代血细胞发生理论认为,造血干细胞衰老会导致"下游"造血细胞出现相应衰老的生物学表现,因此,研究造血细胞衰老规律可以间接推测造血干细胞衰老的变化,也为研究造血干细胞衰老奠定理论与实验室依据.
本研究探讨不同年龄人群骨髓造血细胞衰老的时间动态生物学变化,旨在为进一步研究造血干细胞衰老及其机制奠定理论基础,也为寻找干预其衰老的有效成分和最佳时间提供翔实的实验室依据.
[方法]
1.采集健康自愿者骨髓,根据年龄分为4组: (1)30岁以下组; (2) 30-45岁组;(3) 46-60岁组和(4) 60岁以上组.
2.分离、纯化和培养各年龄组骨髓单个核细胞(hBMMNCs),经贴壁纯化后获得骨髓造血细胞(BMHCs),计算各组自愿者每毫升骨髓液中造血细胞数量.
3. 衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)细胞化学染色,分析不同年龄组BMHCs衰老相关产物表达强度及阳性细胞百分比,以此检查细胞衰老情况.
4. EdU法检测不同年龄组BMHCs增殖能力,流式细胞术检测造血细胞的细胞周期,造血细胞混合集落(CFU-Mix)培养检测BMHCs中造血祖细胞的多向分化能力.
5.酶标比色法检测不同年龄组BMHCs超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量、酶联免疫吸附法(ELISA)测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量,流式细胞术检测活性氧(ROS)含量.
6.Western Blot检测不同年龄组BMHCs衰老相关蛋白表达(P16、P19、P21、P53、CyclinD1)和细胞周期相关蛋白(CyclinE1、CDK2和CDK4).
7.RT-PCR检测不同年龄组BMHCs衰老相关基因p16、p19、p21和p53 mRNA的表达水平.
[结果]
1. 密度梯度离心法可以成功分离hBMMNCs,经贴壁纯化后可以获得BMHCs.
2. 随年龄增加,骨髓标本中BMHCs数量明显减少,如60岁以上人群较30岁以下人群BMHCs数量显著减少.
3. 随年龄增加,SA-β-gal衰老染色阳性的BMHCs数量逐渐增加,且表达阳性强度也增高.
4. 随年龄增加,BMHCs的增殖能力逐渐降低,如46-60岁人群和60岁以上人群较30岁以下人群的细胞增殖能力显著降低,细胞周期发生G1期阻滞,而且CFU-Mix生成数量也逐渐下降.
5. 随年龄增加,BMHCs的抗氧化能力逐渐降低(SOD含量减少),氧化损伤逐渐增加(MDA,GSH,ROS含量明显增多).
6. 随年龄增加,BMHCs的衰老相关蛋白逐渐增加(P16、P19、P21、P53、CyclinD1),细胞周期相关蛋白表达量逐渐减低(CDK2、CDK4、CyclinE1).
7. 随年龄增加,BMHCs的衰老相关基因表达逐渐升高(p16、p19、p21、p53 mRNA).
[结论]
1. 随年龄增长,人骨髓造血细胞将逐渐出现衰老的生物学变化,表现为衰老染色阳性细胞数增多,细胞周期阻滞,增殖能力下降,分化能力降低等.
2. 人骨髓造血细胞随年龄增长的衰老机制可能与氧化应激损伤水平增高,进而激活p16 INK4a-Rb和p19 Arf-Mdm2-p53-p21 Cip1/Waf1信号通路等有关.
人口老龄化报告指出,全球大多数国家已经进入老龄化社会,我国是世界人口最多的国家,也是老年人口最多的国家,且老年化进程极快.现代衰老理论认为,机体衰老是一个缓慢且极为复杂的过程,组织细胞在形态结构和生理功能等方面逐渐出现衰退变化为其主要表现,随着细胞衰老进程的不断推进,必将出现各种老年性疾病.衰老生物学与防治老年性疾病的研究已成为当今生命科学与社会科学共同关注的重要课题.因此,加快推动衰老生物学与防治老年性疾病的研究已经迫在眉睫.
干细胞是指具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,干细胞已经成为现代生命科学领域中最受关注的研究领域之一.现代衰老理论认为,机体所有衰老现象,包括组织器官的退变、功能丧失、肿瘤发生、老年痴呆和反复感染等老年性疾病都反映出成体干细胞衰老水平.干细胞衰老学说是目前阐释机体衰老的最新理论,该学说认为,生物体衰老实际上是自身的干细胞衰老.
血液与造血系统是人体生命活动的源泉.造血干细胞在特定造血微环境的诱导下增殖分化为各系造血祖细胞,造血祖细胞进一步增殖分化形成形态学上可以识别的造血前体细胞,造血前体细胞再逐渐增殖分化形成成熟血细胞,并将其释放到外周血,以维持血细胞数量、比例的动态衡定.在机体衰老早期,尽管外周血成熟血细胞的数量得以维持,但随着衰老进程的推移,造血干细胞数量和功能会逐渐衰退.研究证明,随年龄增长造血干细胞会出现衰老的生物学表现,进而逐渐发生造血功能衰退,甚至出现造血干细胞分化异常而导致白血病的发生.深入探讨造血干细胞衰老机制,寻找延缓其衰老途径至关重要,课题组前期研究证明,小鼠造血干细胞随年龄增加会发生衰老变化,从而导致造血功能衰退.人类造血干细胞是否也会随时间进程发生衰老呢?如何选择延缓造血干细胞衰老的最佳干预时间?这是值得深入研究的课题.
本课题组长期致力于调控干细胞衰老相关研究.目前,已经从人参和当归等天然中药有效成分中寻找到抗衰老有效成分,并通过小鼠体内与体外研究证明,这些抗衰老成分有拮抗致衰剂诱导造血干细胞衰老的作用.人体造血干细胞衰老的时间动态生物学研究远比小鼠困难得多,且迄今未见相关报道.现代血细胞发生理论认为,造血干细胞衰老会导致"下游"造血细胞出现相应衰老的生物学表现,因此,研究造血细胞衰老规律可以间接推测造血干细胞衰老的变化,也为研究造血干细胞衰老奠定理论与实验室依据.
本研究探讨不同年龄人群骨髓造血细胞衰老的时间动态生物学变化,旨在为进一步研究造血干细胞衰老及其机制奠定理论基础,也为寻找干预其衰老的有效成分和最佳时间提供翔实的实验室依据.
[方法]
1.采集健康自愿者骨髓,根据年龄分为4组: (1)30岁以下组; (2) 30-45岁组;(3) 46-60岁组和(4) 60岁以上组.
2.分离、纯化和培养各年龄组骨髓单个核细胞(hBMMNCs),经贴壁纯化后获得骨髓造血细胞(BMHCs),计算各组自愿者每毫升骨髓液中造血细胞数量.
3. 衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)细胞化学染色,分析不同年龄组BMHCs衰老相关产物表达强度及阳性细胞百分比,以此检查细胞衰老情况.
4. EdU法检测不同年龄组BMHCs增殖能力,流式细胞术检测造血细胞的细胞周期,造血细胞混合集落(CFU-Mix)培养检测BMHCs中造血祖细胞的多向分化能力.
5.酶标比色法检测不同年龄组BMHCs超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量、酶联免疫吸附法(ELISA)测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量,流式细胞术检测活性氧(ROS)含量.
6.Western Blot检测不同年龄组BMHCs衰老相关蛋白表达(P16、P19、P21、P53、CyclinD1)和细胞周期相关蛋白(CyclinE1、CDK2和CDK4).
7.RT-PCR检测不同年龄组BMHCs衰老相关基因p16、p19、p21和p53 mRNA的表达水平.
[结果]
1. 密度梯度离心法可以成功分离hBMMNCs,经贴壁纯化后可以获得BMHCs.
2. 随年龄增加,骨髓标本中BMHCs数量明显减少,如60岁以上人群较30岁以下人群BMHCs数量显著减少.
3. 随年龄增加,SA-β-gal衰老染色阳性的BMHCs数量逐渐增加,且表达阳性强度也增高.
4. 随年龄增加,BMHCs的增殖能力逐渐降低,如46-60岁人群和60岁以上人群较30岁以下人群的细胞增殖能力显著降低,细胞周期发生G1期阻滞,而且CFU-Mix生成数量也逐渐下降.
5. 随年龄增加,BMHCs的抗氧化能力逐渐降低(SOD含量减少),氧化损伤逐渐增加(MDA,GSH,ROS含量明显增多).
6. 随年龄增加,BMHCs的衰老相关蛋白逐渐增加(P16、P19、P21、P53、CyclinD1),细胞周期相关蛋白表达量逐渐减低(CDK2、CDK4、CyclinE1).
7. 随年龄增加,BMHCs的衰老相关基因表达逐渐升高(p16、p19、p21、p53 mRNA).
[结论]
1. 随年龄增长,人骨髓造血细胞将逐渐出现衰老的生物学变化,表现为衰老染色阳性细胞数增多,细胞周期阻滞,增殖能力下降,分化能力降低等.
2. 人骨髓造血细胞随年龄增长的衰老机制可能与氧化应激损伤水平增高,进而激活p16 INK4a-Rb和p19 Arf-Mdm2-p53-p21 Cip1/Waf1信号通路等有关.