【摘 要】
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肺炎支原体（MP）是影响老年人长寿和儿童健康最重要的病原体之一,但针对MP的人用疫苗全球尚未研发成功,其原因包括MP灭活疫苗免疫原性较差且有免疫激化副反应,亚单位疫苗保护效果不佳,而MP减毒活疫苗存在残留毒力和毒力返祖等副作用。因此本研究提出以流感病毒株作为载体研制MP基因工程疫苗的新思路。流感病毒甲型毒株A/Puerto Rico/8/34（H1N1）（简称PR8）是鸡胚适应株,世界卫生组织将其
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肺炎支原体（MP）是影响老年人长寿和儿童健康最重要的病原体之一,但针对MP的人用疫苗全球尚未研发成功,其原因包括MP灭活疫苗免疫原性较差且有免疫激化副反应,亚单位疫苗保护效果不佳,而MP减毒活疫苗存在残留毒力和毒力返祖等副作用。因此本研究提出以流感病毒株作为载体研制MP基因工程疫苗的新思路。流感病毒甲型毒株A/Puerto Rico/8/34（H1N1）（简称PR8）是鸡胚适应株,世界卫生组织将其推荐为流感病毒疫苗株供体株。本课题以PR8流感病毒株为载体,在非结构蛋白NS基因中插入MP粘附因子P1、P30的主要抗原基因P1a、P30a,构建重组载体NS-P1a或NS-P30a,连同PR8的其余7个片段的重组质粒共转染HEK293T细胞后,接种鸡胚培养并拯救出重组流感病毒rFLU-P1a和rFLU-P30a。对重组病毒做RT-PCR鉴定扩增出P1a（693bp）、P30a（774bp）、NSP1a（1992bp）和 NSP30a（2073bp）条带,测序结果正确。在鸡胚中连续传5代并测血凝效价,rFLU-P1a和rFLU-P30a分别稳定在1:128和1:32,PCR鉴定扩增出P1a、P30a条带,表明重组病毒可以稳定传代。rFLU-P1a和rFLU-P30a大规模接种鸡胚培养收获尿囊液,经连续流离心澄清、0.45μm滤柱、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、脱糖和0.2μm除菌过滤后,收获病毒纯化液,进行血凝效价、卵清蛋白等的检测,结果显示rFLU-P1a、rFLU-P30a病毒纯化液血凝效价分别为1:1024和1:256,卵清蛋白均<31.3 ng/mL。电镜观察重组病毒形态,可见病毒具有囊膜。测定rFLU-P1a和rFLU-P30a感染性滴度lgTCID50/mL分别为8.3和8.2。将高（原倍）、中（106TCID50）、低（1 05TCID50）剂量的重组病毒分别滴鼻/肌注接种BALB/c小鼠,25μl/只,免疫两次（间隔21天）,并设置空白对照组和PR8病毒对照组,进行如下免疫原性评价实验:①酶联免疫吸附实验检测血清中MP抗体,一免结果显示rFLU-P1a和rFLU-P30a组OD值均显著高于空白对照组（0.0710±0.01039）和 PR8 对照组（0.07825±0.006065）（P<0.05）,其中以 rFLU-P1a 和rFLU-P30a高剂量滴鼻组最为显著（分别为0.5815±0.03402和0.6151±0.03011）,同剂量滴鼻组抗体水平高于肌注组,二免与一免结果无显著差异。②MP代谢抑制实验结果显示rFLU-P1a滴鼻组和肌注组高、中、低剂量一免血清几何平均滴度（GMT）分别为 13.93、8、2、6.96、2.30 和 0,rFLU-P30a 的 GMT 分别为 13.93、6.96、2、6.06、2.30和0,可见同剂量滴鼻组高于肌注组,高、中剂量组结果显著高于低剂量组,且都高于空白对照组和PR8对照组,二免与一免结果相似。③免疫荧光法检测MP粘附抑制实验,可在荧光显微镜下看到rFLU-P1a和rFLU-P30a高、中剂量组血清能抑制MP对A549细胞的粘附。④血凝抑制（HI）试验结果显示PR8对照组、rFLU-P1a和rFLU-P30a滴鼻组HI抗体效价水平均高于1:40,显著高于空白对照组（P<0.05）。⑤对小鼠进行MP攻毒实验,测量湿重肺指数、肺组织MP计数、肺组织病理学切片等,结果表明rFLU-P1a和rFLU-P30a滴鼻免疫小鼠能保护MP对其的损伤。本研究首次在流感病毒载体NS基因内插入肺炎支原体P基因,拯救出的重组病毒免疫小鼠能够产生抗MP和抗流感的免疫应答,为MP疫苗的研制奠定了基础,具有重要的社会意义和应用价值。
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