随着人们的饮食条件和饮食结构不断发生变化,饮食中动物性油脂及胆固醇等脂类物质对人体健康的影响越来越受到人们的关注。肝脏是研究脂代谢的重要靶器官,它是内源性和外源性脂代谢途径的交汇点及调节中心,能够合成、释放各种脂蛋白及脂代谢酶类,在维持脂代谢平衡中发挥着重要作用。饮食中的动物性油脂及胆固醇可通过对体内脂代谢相关基因表达的影响进一步影响血脂代谢及肝脏中的脂质代谢,从而引起体内的脂质代谢紊乱。脂代谢紊乱会导致体内出现高脂血症,例如高胆固醇血症和高甘油三酯血症等,对心血管疾病的发生起到一定的促进作用。心血管疾病严重威胁着人类的健康,由其导致的死亡率呈逐年上升且年轻化的趋势,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是其病理生理基础。关于AS的发病机制存在多种学说,主要是由多种因素引起脂代谢紊乱学说,而在机体内与脂代谢相关的基因、外界环境调节的刺激以及内外因素的相互影响共同参与并促进了AS发生发展,因此阐明饮食尤其是富含高脂高胆固醇的饮食对影响血脂代谢及肝脏脂代谢的相关基因以及研究这些基因之间的相互作用机理,将有助于人们真正弄清脂代谢紊乱引起的AS的发生机制和病理生理特点,为预防和治疗用药物的开发、饮食防治与治疗策略的制定提供理论依据。目前,国内外对AS发病前期和早期的脂代谢相关基因表达变化报道不多,多局限在脂代谢相关基因的敲除、抑制或过表达后对AS的影响上,对幼龄载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)缺失(apoE-/-/LDLR-/-)小鼠辅以不同饮食来研究其肝脏脂代谢相关基因变化的研究报道更为有限。本实验采用经典的AS小鼠模型,研究了在apoE、LDLR双基因缺失及高脂高胆固醇饮食条件下,基因与基因及基因与环境间的相互作用对血脂变化、主动脉根部和肝组织病理形态改变,以及对肝脏组织重要基因表达变化规律的影响,并分析了上述变化与高脂血症乃至AS发生发展的关系,为AS发病机制的研究及AS饮食防治、药物开发提供理论依据和研究平台。本实验利用半定量RT-PCR和荧光实时定量RT-PCR技术,分析3、4、8和12周龄不同饮食(高脂高胆固醇饮食或普通饮食)喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠与相同遗传背景的同龄野生型(wide type,WT)小鼠肝脏脂代谢相关基因PPARa、LXRa以及这些基因的靶基因的表达特征,并进行血生化指标及主动脉和肝脏病理形态学检测。实验结果显示:1)脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是水解甘油三酯(triglyceride,TG)的关键酶,血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like protein 3,Angptl 3)和载脂蛋白AV(apolipoprotein AV,apoAV)对LPL的活性分别起到抑制和激活作用。从4周龄开始,高脂高胆固醇饮食条件下的apoE-/-/LDLR-/-小鼠肝脏Angptl3的表达量明显高于普通饮食下的表达量(P<0.01)。在WT小鼠体内也出现同样的现象(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠12周龄时,LPL的表达量显著低于正常饮食的apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.01);高脂高胆固醇饮食喂养的WT小鼠12周龄时,LPL的表达量显著高于正常饮食喂养的WT小鼠(P<0.01)。ApoAV的表达量在apoE-/-/LDLR-/-和WT小鼠肝脏内并未因饮食的改变而改变。2)载脂蛋白F (apolipoprotein F,apoF)、清道夫受体BI(scavenger receptor class BI,SR-BI)、载脂蛋白AI(apolipoprotein A I,apoAI)和载脂蛋白AIV(apolipoprotein A IV,apoAIV)在胆固醇逆转运过程中发挥重要作用。从4周龄开始,高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠apoF表达量显著低于普通饮食喂养的双基因缺失小鼠(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食喂养的WT小鼠从8周龄开始apoF表达量显著高于普通饮食下的WT小鼠(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠肝脏中清道夫受体BI(scavenger receptor class BI,SR-BI)的表达量在12周龄时显著低于普通饮食的双基因缺失小鼠(P<0.05),高脂高胆固醇饮食喂养的WT小鼠12周龄时其SR-BI的表达量显著高于普通饮食喂养的正常鼠(P<0.01)。载脂蛋白A(Iapolipoprotein A I,apoAI)在高脂高胆固醇饮食条件下的apoE-/-/LDLR-/-和WT小鼠肝脏内的表达均低于普通饮食小鼠(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食条件下的apoE-/-/LDLR-/-肝脏载脂蛋白AIV(apolipoprotein A IV,apoAIV)表达水平均低于普通饮食小鼠(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食和普通饮食喂养的WT小鼠,apoAIV的表达没有显著性差异。3)载脂蛋白B100(apolipoprotein B100,apoB100)是LDL的重要组分之一,对于维持LDL结构的完整及血清胆固醇水平的相对稳定起着重要的作用。12周龄时高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠较普通饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠apoB100明显上调(P<0.01)。3至9周龄期间,两种饮食喂养的双基因缺失小鼠肝脏apoB100的表达量无明显差异,而3至12周龄期间,野生型小鼠无论喂以何种饮食,其肝脏apoB100的表达量均无明显变化。4)脂肪酸转运体(fatty acid translocase,FAT/CD36)、肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)、酰基辅酶A氧化酶1(acyl-coenzymeA oxidase 1,ACOX1)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰基辅酶A脱氢酶1(Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1)在脂肪酸代谢过程中发挥重要作用,其中FAT/CD36在长链脂肪酸的吸收中发挥重要的作用,CPT1和ACOX1是脂肪酸氧化过程的关键酶,FAS和SCD1在脂肪酸合成过程中发挥关键性作用。12周龄时高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-和WT小鼠FAT/CD36的表达水平较普通饮食喂养的相同基因型小鼠显著上调(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠12周龄时CPT1的表达量与普通饮食喂养的双基因缺失小鼠无显著差异,相同年龄的高脂高胆固醇饮食喂养的WT小鼠CPT1的表达量较正常饮食喂养的同基因型小鼠显著上调(P<0.05)。相同年龄、不同饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠ACOX1的表达量未发生明显变化,而高脂高胆固醇饮食条件下的WT小鼠在8和12周龄时其肝脏ACOX1的表达量较普通饮食下正常小鼠显著上调(P<0.05)。在8和12周龄时,高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-和WT小鼠FAS表达水平均高于普通饮食喂养的相同基因型小鼠(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-在12周龄时SCD1显著高于正常饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.01)。5)上述脂代谢相关基因是肝X受体(liver X receptor,LXRα)或过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)的靶基因。高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-和WT小鼠核转录因子LXRα的mRNA水平在8和12周龄时较同龄正常饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-和WT小鼠明显升高(P<0.05)。12周龄时在高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠肝脏中,另一个核转录因子PPARα的表达显著高于普通饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.01)。高脂高胆固醇饮食喂养的WT小鼠12周龄时PPARα表达较同龄普通饮食下的WT小鼠也显著上调(P<0.05)。6)ApoE-/-/LDLR-/-小鼠血清血浆总胆固醇(total cholesterol,TC)、TG、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)含量均高于同龄WT小鼠,并随年龄增长而升高。高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠血清TC和LDL-C含量从4周龄开始显著高于普通饮食喂养的同龄apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.05),血清HDL-C含量从8周龄开始显著高于普通饮食喂养的同龄apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.05),血清TG含量在12周龄时显著高于普通饮食喂养的同龄apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.05)。高脂高胆固醇饮食喂养的WT小鼠血清HDL-C含量从4周龄开始显著高于普通饮食喂养的同龄apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.05),血清TC和LDL-C含量从8周龄开始显著高于普通饮食喂养的同龄apoE-/-/LDLR-/-小鼠(P<0.05)。7)各年龄时期,高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-/LDLR-/-小鼠主动脉根部病变较普通饮食下的apoE-/-/LDLR-/-小鼠严重,肝脏脂质沉积也明显加重。WT小鼠无明显病变。4周龄时,apoE-/-/LDLR-/-小鼠普通饮食时就伴有轻微的主动脉根部内膜损伤和肝脏脂质沉积,高脂高胆固醇饮食时略有增加。8-12周龄时,高脂高胆固醇饮食喂养的该小鼠病变程度明显重于普通饮食组。随年龄增长,病变程度明显加深。在高脂高胆固醇饮食影响下,部分脂代谢基因表达水平发生一定的变化,基因变化的综合效应在不同程度上引起脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化,说明高脂高胆固醇饮食可能通过影响这些基因以发挥其在幼龄AS小鼠脂质代谢紊乱过程中的重要作用,从而加速AS早期病变的发生。我们的研究还发现,经过高脂高胆固醇饮食的干预,apoE-/-/LDLR-/-和野生型小鼠体内的脂代谢出现不同的变化,同时相关基因的变化与正常饮食组有明显不同。这表明高脂高胆固醇饮食和正常饮食对apoE-/-/LDLR-/-和野生型小鼠的影响机制是不同的,同时apoE-/-/LDLR-/-小鼠比正常小鼠的变化更为显著,这主要是因为apoE-/-/LDLR-/-小鼠还存在一定的基因缺陷。这一发现表明,肝病患者或脂代谢障碍患者对高脂肪饮食有不同的反应,并对AS疾病有更多的敏感性。