背景中医理论认为“肾精通于脑”,即肾藏精主骨生髓,髓充于脑。肾精亏虚会导致髓脑空虚,影响大脑认知功能。中医临床以“补肾填髓”方药治疗“髓海不足”引起的认知障碍。“神经血管单元”是反映大脑结构和功能动态整体性的基本单位,也是认知功能的主体。课题组假设“促红细胞生成素(EPO)可能是肾精的重要物质基础”,前期研究发现“阴阳双调、补肾益精”经典方剂右归饮具有脑保护作用,且能上调EPO的表达。本课题拟利用腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠模型和体外“脑神经血管单元”模型,观察右归饮对腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠认知功能障碍的改善作用和对“脑神经血管单元”的体内外整体保护作用,验证中药“补肾益精健脑”作用机制与EPO生物作用的相关性。本课题受到国家自然科学基金面上项目(81473549)资助。目的观察右归饮对体内外“脑神经血管单元”损伤的保护作用及其与EPO的相关性,阐释“补肾益精健脑”疗效的生物学作用机制。方法1.腺嘌呤致慢性肾衰大鼠模型的复制及其“脑神经血管单元”和EPO变化观察方法(1)模型的复制及模型成功评价标准:①造模方法:雄性SD大鼠150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃,每日1次,连续2周。②模型成功的判断标准:第2周结束日测定血清和尿液中肌酐含量,计算内生肌酐清除率(Ccr),以每一只大鼠的Ccr<0.21 mL·min-1判定为造模成功,用于后续试验。③模型维持:从第3周开始150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃每隔1日1次,连续4周。(2)模型大鼠体质及认知功能的评价:造模6周结束日,收集尿液;进行Morris水迷宫实验和前脉冲抑制实验评价大鼠定位能力和选择性注意能力;行为学试验后取血并除死动物,观察各组动物肾脏大体形态学及其石蜡切片组织形态学;全自动血液生化仪测定血清和尿液中CREA含量并计算Ccr;酶联免疫吸附法测定血清中ACTH、CORT、T的含量;血液细胞分析仪检测全血中RBC、HGB、HCT。(3)模型大鼠“脑神经血管单元”和EPO变化观察:行为学试验后取血,处死动物并取脑组织,酶联免疫吸附法测定血清中EPO含量;免疫印迹法检测脑组织中EPO含量;制作大脑冰冻切片,免疫荧光法观察“脑神经血管单元”。2.右归饮对慢性肾衰大鼠的改善作用及其与EPO相关性研究方法(1)动物分组及给药:将模型成功大鼠随机分为模型组和右归饮8 g·kg-1、16 g·kg-1、32 g·kg-1组。分组之后,给药之前,对各组动物损伤程度的均衡性进行检验,统计学结果显示无显著性差异后方给予药物。第3周开始,右归饮各组每日灌胃给予经过质量控制的右归饮配方颗粒液,均连续灌胃4周,同时模型维持150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃每隔1日1次,连续4周。(2)观察指标及检测方法:各组动物体质、认知功能、“脑神经血管单元”和EPO检测方法同上。免疫印迹法检测大脑皮层和海马区EPOR、P-EPOR、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白的相对表达量。3.右归饮对体外“脑神经血管单元”的促生长与保护作用及其EPO相关性研究方法(1)模型复制、损伤及分组:①采用大鼠大脑皮层微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元3种原代细胞复制体外“脑神经血管单元”模型;②将复制的“脑神经血管单元”正常模型随机分为空白组、右归饮50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200μg·mL-1组,空白组常规培养,右归饮各组给予相应浓度的右归饮药液,培养24 h;③用缺氧缺糖培养液培养“脑神经血管单元”模型形成损伤8 h后,以细胞数量、轴突长度和细胞跨内皮电阻值显著低于正常培养孔为标准,判定氧糖剥夺“脑神经血管单元”损伤模型成功;④将“脑神经血管单元”损伤模型随机分为氧糖剥夺损伤模型组、右归饮50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1组,右归饮各组在氧糖剥夺处理同时给予相应浓度的右归饮药液。(2)观察指标及方法:①观察正常模型及右归饮各组细胞形态,测量神经元轴突长度,计数微血管内皮细胞和星形胶质细胞数量,免疫印迹法检测EPO、GAP43的相对表达量;②观察损伤模型及右归饮各组细胞形态,测量神经元轴突长度;荧光双标流式细胞仪检测3种细胞凋亡率;免疫印迹法检测EPO、EPOR、P-EPOR、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3的相对表达量。结果1.腺嘌呤致慢性肾衰模型大鼠体质、脑组织与认知功能显著异常。①与空白组比较,模型组大鼠血清CREA显著升高,尿液中CREA显著下降,Ccr显著下降(均P<0.01),提示慢性肾衰造模成功;②与空白组比较,模型组体重显著下降(P<0.01),肾脏明显肿胀,颜色苍白,出现“大白肾”,肾小球骤缩,肾髓质可见较多空泡和棕褐色腺嘌呤结晶;③与空白组比较,模型组血清中ACTH、T、CORT的含量显著升高,全血中RBC、HGB、HCT显著下降(均P<0.01);④与空白组比较,模型组在前脉冲刺激分别为73 dB和82 dB时的前脉冲抑制值显著降低,第4天、第5天逃避潜伏期显著延长,穿越平台次数、穿越平台象限时间比、穿越平台象限距离比显著减少(均P<0.01);⑤与空白组比较,模型组海马区“脑神经血管单元”明显损伤:星形胶质细胞数量显著增加,微血管数量显著降低,神经元轴突显著丢失(均P<0.05);⑥与空白组比较,模型组血清中EPO含量、大脑皮层和海马区EPO含量显著降低(均P<0.01)。2.右归饮能显著改善腺嘌呤致慢性肾衰模型大鼠体质与认知功能。①与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠体重显著升高(P<0.05),“大白肾”症状得到改善,肾小球骤缩程度减轻,肾髓质空泡和腺嘌呤结晶减少;②与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠Ccr显著升高,血清中ACTH、CORT、T的含量显著降低,右归饮16～32 g·kg-1组全血中RBC、HGB、HCT显著升高(均P<0.05);③与模型组比较,右归饮16～32 g·kg-1组PPI显著升高,第4天、第5天逃避潜伏期显著缩短,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠穿越平台次数,穿越平台象限时间比、穿越平台象限距离比显著增加(均P<0.05)。3.右归饮能显著改善腺嘌呤致慢性肾衰模型大鼠“脑神经血管单元”损伤。①与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠海马区星形胶质细胞显著减少(P<0.05);②与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠马区微血管数量显著增加(P<0.05);③与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠海马区神经元轴突丢失显著减少(P<0.05)。4.右归饮能显著逆转腺嘌呤致慢性肾衰模型大鼠EPO含量及其信号通路异常。①与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组血清中EPO含量显著增加(P<0.05);②与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大脑皮层和海马区EPO含量显著升高(P<0.05);③与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠海马区EPOR、P-JAK2、STAT3、P-STAT3的表达显著升高,JAK2的表达显著降低(均P<0.05);④与模型组比较,右归饮8～32 g·kg-1组大鼠大脑皮层P-EPOR、P-JAK2、P-STAT3显著升高,右归饮32 g·kg-1组皮层 P-EPOR/EPOR、P-JAK2/JAK2、P-STAT3/STAT3 比值显著升高(均P<0.05)。5.右归饮对“脑神经血管单元”体外模型中3种细胞及EPO具有显著促进作用成功复制了上述3种原代细胞共培养的“脑神经血管单元”体外模型。与空白组比较,右归饮50～200 μg·mL-1组模型中微血管内皮细胞和星形胶质细胞活细胞数量,神经元轴突长度均显著增加;右归饮100～200 μg·mL-1组GAP43和EPO的表达均显著增加(均P<0.05)。6.右归饮对氧糖剥夺“脑神经血管单元”体外损伤模型具有显著保护作用①成功复制了氧糖剥夺“脑神经血管单元”体外损伤模型。与空白组比较,氧糖剥夺损伤模型组神经元、脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体收缩;脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞活细胞数量、神经元轴突长度及跨内皮电阻值均显著降低(均P<0.01);②与空白组比较,氧糖剥夺损伤模型组神经元轴突长度变短,3种细胞凋亡率显著上升,Bcl-2表达显著减少,Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3表达显著增加(均P<0.01);③与氧糖剥夺损伤模型组比较,右归饮50～200 μg·mL-1组神经元轴突显著增长,3种细胞凋亡率显著降低,Bcl-2的表达显著升高,Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3 的表达显著降低(均P<0.05)。7.右归饮能显著逆转氧糖剥夺“脑神经血管单元”体外损伤模型EPO及信号通路异常①与空白组比较,氧糖剥夺损伤模型组EPO含量显著下降(P<0.01);与氧糖剥夺模型组比较,右归饮50～200 μg·mL-1组EPO表达显著增加(P<0.05);②与空白组比较,氧糖剥夺损伤模型组P-EPOR、JAK2、P-JAK2表达显著减少,EPOR、STAT3表达显著增加,P-EPOR/EPOR、P-STAT3/STAT3比值显著降低(均P<0.01);③与氧糖剥夺损伤模型组比较,右归饮100～200 μg·mL-1组P-EPOR、JAK2、P-JAK2表达显著升高,EPOR、STAT3 表达显著降低,P-EPOR/EPOR、P-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.05)。结论1.腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠具有显著的认知功能障碍,并伴随着海马区“脑神经血管单元”结构损伤及体内EPO含量显著降低。2.右归饮对腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠体质及认知功能障碍具有显著的改善作用,对海马区“脑神经血管单元”具有显著的保护作用,其作用机制与升高血中和脑内EPO含量,调节EPO下游JAK2-STAT3通路相关。3.右归饮能显著促进“脑神经血管单元”体外模型中3种细胞的生长及EPO表达;对氧糖剥夺损伤的“脑神经血管单元”体外模型具有显著的保护作用,其保护作用机制与升高EPO含量,调节EPO下游JAK2-STAT3通路相关。4.上述结果提示,阴阳双补、填精补髓的经典名方右归饮“补肾益精健脑”作用的机制与EPO的生物作用相关。