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转录是生物体最重要的生命活动过程之一,启动子作为基因转录与调控中的核心元件,直接影响生物体性状的形成及其对外界环境的适应性。Arthrobactersp.A3是从乌鲁木齐河源1号冰川永久冻土中分离的一株具有较高G+C比例的革兰氏阳性菌,其生长环境极端。为了深入研究并阐明其抗逆机制,本实验以Arthrobacter sp. A3为材料进行了冷诱导启动子筛选的研究,构建了启动子探针载体,筛选了9个冷诱导启动子并对其强度进行了测定,为后续的功能研究奠定基础。主要研究结果如下：(1)以pART2质粒为基础,去除pART2质粒的启动子片段,3种阅读框架不同的Amp-gfp融合基因作为报告基因,构建了能在Arthrobacter sp.和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pART2-SP-Amp-gfp.(2)采用CTAB法提取节杆菌Arthrobacter sp.A3基因组DNA，用Sau3AI进行部分酶切后与BamHI酶切并去磷酸化的探针质粒pART2-SP-Amp-gfp连接构成启动子探针质粒库,将质粒库电击转化入节杆菌Arthrobacter sp. A3,共得到约900000个转化菌落。(3)重组质粒pET-28-gfp的构建。利用其诱导表达GFP-His6融合蛋白,并经His亲和柱纯化得到了重组蛋白。以纯化的融合蛋白GFP-His6作为抗原,通过免疫家兔制备多克隆抗体,并利用Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的灵敏度和特异性。结果表明,GFP多克隆抗体效价均达到1：100000以上,将蛋白-Sepharose CL-6B与血清杂交,得到纯化的GFP抗体片段。(4)应用全波长酶标仪初步筛选挑出9个低温胁迫下表达量较高的冷诱导启动子,之后应用Western Blot检测低温处理下GFP在Arthrobacter sp. A3体内的表达,进而验证启动子的强度,并通过PCR扩增发现冷诱导启动子大小约为200bp-400bp。综上所述,本研究构建了pART2-SP-Amp-gfp启动子探针质粒,获得了节杆菌启动子筛选菌株库。体外表达并纯化了GFP融合蛋白,制备了多克隆抗体。应用全波长酶标仪和GFP抗体筛选并验证9个冷诱导启动子,并发现冷诱导启动子大小约为200bp-400bp。以上的研究结果为进一步揭示基因表达调控机制奠定了良好的基础,从而更好的阐释冻土微生物低温生存的抗逆机理,具有一定的理论意义和应用前景。