背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞(fibroblasts,FBs)。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP(+)、油红O染色(+)、βIII-微管蛋白(+)、神经丝(+)、HMB45(+)和TYR(+)。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin(+)、CK(pan)(+)和KI-67(+)阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。