稀有人参皂苷靶向抑制HSP90A-Cdc37系统的抗肿瘤作用研究

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人参皂苷是具有生物活性的人参代谢产物,具有良好的抗炎症作用,并在癌症、糖尿病与高血脂等疾病治疗中显示较好的功效。主要人参皂苷Rb1、Rb2、Rg1、Re、Rf、Rc与Rd的丰度较高,约占人参皂苷总量的80–90%,但由于其分子结构中所带糖基较多,分子量较大,导致其生物利用度较低。红参是人参根部经过蒸煮晾晒得到的加工产品,富含多种稀有人参皂苷,这些稀有人参皂苷是由主要人参皂苷在人参加工过程中发生去糖基化转化而来。二醇型人参皂苷Rb1、Rd与Rc在加热过程中会脱去第20号碳上的糖基,并逐步转化为(20S)G-Rg3、(20R)G-Rg3、(20S)G-Rh2、(20R)G-Rh2、G-Rg5与G-Rk1等稀有人参皂苷。众多研究表明,稀有人参皂苷具有相对较高的生物活性与口服生物利用度,因此更适合用于药物的研发。近年来,人们对于稀有人参皂苷的关注主要集中在其抗肿瘤机制的研究。我们的前期研究表明,人参皂苷(20S)G-Rh2可以同时启动膜死亡受体介导的外源细胞凋亡途径和线粒体介导的内源细胞凋亡途径,并迅速杀死人源宫颈癌He La细胞、非小细胞肺癌A549细胞、肝癌Hep G2细胞、乳腺癌MCF-7细胞。此外,C-K、G-Rk1与G-Rg5等稀有人参皂苷也对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用。我们选择(20S)G-Rh2作为研究对象,旨在通过对其肝癌细胞内靶点的筛选与研究,深入探究(20S)G-Rh2的抗肿瘤作用机制。利用共价连接(20S)G-Rh2或(20R)G-Rh2的PEGA树脂来富集Hep G2细胞裂解液中的蛋白质。随后利用液相色谱串联质谱对PEGA树脂上洗脱下来的蛋白质进行组学分析,发现有355个蛋白质与(20S)G-Rh2和(20R)G-Rh2均存在一定程度的结合。根据蛋白质在两种人参皂苷中富集程度的差异,得到了214个更倾向结合(20S)G-Rh2的蛋白质(Ratio R/S<1)。结合对Gene Cards数据库中肝癌相关基因的调查,进一步筛选出25个研究目标(包括STAT3、HSP90AA1、TRIP13、HSPB1、SFN、ACTB、KRT18、NPM1、HSPA5、ITGB1、KRT8、HSPA9、MSH2、HSPA4、PHB、HSP90B1、ANXA2、IQGAP1、COX5A、CD44、FASN、MSH6、BSG、LRRC59与PC)。随后我们通过对这25个潜在靶点的网络药理学分析与基因富集分析,推理出HSP90A(由HSP90AA1基因编码)可能是(20S)G-Rh2抑制肝癌细胞增殖的关键靶蛋白。对TCGA肝癌数据集的调查显示,HSP90A的含量与肿瘤恶性程度呈正相关,而与患者总体生存率呈负相关,这表明HSP90A很可能在肝癌的发生发展中起关键作用。热休克蛋白Hsp90家族包括HSP90A、HSP90B、Grp94与Trap1四个成员,它们的主要功能是帮助新生多肽的正确折叠,促进数百种蛋白质的成熟。Hsp90在多种肿瘤组织中高表达,高表达的Hsp90被认为是膀胱癌、食管癌和肺癌等多种癌症预后不良的标志。Hsp90通过稳定与激活癌症相关蛋白质,来调节肿瘤细胞的生长、粘附、侵袭、转移与血管生成。为验证HSP90A与(20S)G-Rh2的相互作用,我们进行了分子对接计算与蛋白质热漂移分析。结果显示,(20S)G-Rh2可以结合HSP90A,并且可能同时占据HSP90A上的ATP结合位点与Cdc37结合位点。这提示我们,(20S)G-Rh2可能影响HSP90A与Cdc37的相互作用。Cdc37作为研究较多的Hsp90分子伴侣之一,参与多种激酶的调节。首先,活化的Cdc37会选择性识别并结合未折叠的客户蛋白,将其招募至Hsp90同源二聚体上。随后,Cdc37发生去磷酸化并与复合体解离,Hsp90二聚体发生构象改变,水解ATP来完成对客户蛋白的加工。根据这一分子机制,我们进行了免疫共沉淀实验,证实了(20S)G-Rh2可以抑制HSP90A与Cdc37的相互作用,预示其客户蛋白周期蛋白依赖性激酶CDKs(cyclin-dependent kinases)的成熟会受到影响。为验证这一推测,我们对细胞周期调控蛋白的含量进行了免疫印迹分析。结果显示,(20S)G-Rh2作用下,周期蛋白依赖性激酶CDK1、CDK2、CDK4与CDK6的含量均明显降低。此外,细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B与Cyclin E的含量出现显著降低,而Cyclin D和p21的含量则显著上调。Cyclin D-CDK4/6为细胞周期G0-G1期促进因子,可以通过对其底物Rb的磷酸化来解除Rb蛋白对E2F转录因子的抑制作用。正如我们推测的那样,在(20S)G-Rh2作用下,Rb蛋白质的磷酸化程度明显降低,细胞周期滞留在G0-G1期。Cyclin E和Cyclin A分别为G1-S期和S期的周期调控蛋白,也是E2F转录因子的下游靶蛋白,而结果同样显示,Cyclin E、Cyclin A与Cyclin B的含量也出现(20S)G-Rh2浓度依赖的下调。在相同条件下,Cyclin D与p21的蛋白含量则明显上调。我们认为是CDK4和CDK6蛋白含量的降低导致了Cyclin D的代偿性上调。细胞活力测定结果显示,(20S)G-Rh2以剂量依赖的方式抑制了人肝癌Hep G2细胞与SK-HEP-1细胞的增殖,其IC50值分别为5.02μM与5.25μM。实时荧光定量PCR的结果显示,(20S)G-Rh2作用下CDK2、CDK4与CDK6的m RNA含量不但没有降低反而呈现上升趋势,说明(20S)G-Rh2作用下CDKs蛋白含量的降低是由于蛋白质降解引起的。随后我们探究了CDKs的降解途径,发现(20S)G-Rh2引起的CDKs蛋白降解依赖于蛋白酶体途径而非自噬溶酶体途径。综上,我们阐明了(20S)G-Rh2在肝癌细胞中的抗肿瘤机制,即(20S)G-Rh2通过靶向HSP90A来抑制HSP90A-Cdc37系统,从而影响CDKs蛋白的成熟并引起肝癌细胞的G0-G1期阻滞。基于人参皂苷分子结构的相似性,我们利用分子对接计算了HSP90A与其他人参皂苷相互作用的可能性,并筛选出G-Rk1与G-Rg5作为接下来的研究对象。参考(20S)G-Rh2的研究思路,我们又相继阐明了G-Rk1与G-Rg5在Hep G2细胞中的抗肿瘤作用机制,即两种人参皂苷都可以通过靶向结合HSP90A,抑制其与Cdc37的相互作用,来影响CDKs蛋白的正确折叠并引起肝癌细胞的G2-M期阻滞。作为天然产物的人参皂苷,区别于人工设计合成的化合物,能够靶向多个蛋白质来有效调控疾病相关信号通路,从而在一定程度上降低耐药性的产生。例如我们在前期研究中发现,(20S)G-Rh2可以通过靶向抑制Annexin A2来促进肿瘤细胞的细胞凋亡。此外,人参皂苷与靶蛋白的相互作用较温和,因此产生的副作用往往较小,这些都说明人参皂苷是具有良好前景的抗肿瘤辅助治疗药物。
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