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北极海洋链霉菌Streptomyces sp. R-527F分离自北冰洋海域沉淀物,该菌株可合成大环四重内酯类抗生素二活菌素(Dinactin)。该化合物及其同系物具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗原生动物、杀虫和免疫抑制的活性。本文主要通过系统的pH-营养调控研究来促进Streptomyces sp. R-527F生产二活菌素,以解决药源不足的问题。首先,均衡的培养基营养组成是促进产量提高的基础。本课题以原始培养基为基础,通过单因素的方法筛选得到最佳的碳氮源,然后通过正交、Plackett-Burman设计等统计学方法对培养基进行了优化,使二活菌素的产量达到到252 mg/L,提高了6.6倍。其次,外源前体的添加往往直接参与次级代谢产物合成,促进目的产物产量提高。在对二活菌素生物合成途径分析的基础上,添加其合成过程中的间接前体甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸,结果发现当添加0.50mmol/L苏氨酸、0.50 mmol/L异亮氨酸、0.25 mmol/L谷氨酸时,二活菌素的最高产量分别比对照组提高了25%、12%、13%。同时,研究了不同浓度的直接前体乙酸钠、丙二酸钠、丁二酸钠、甲基丙二酸钠、丙酸钠在不同的时间点添加对二活菌素合成的影响,发现总量为6.00 mmol/L的丁二酸钠平均分成6份,从48 h开始每隔12 h添加一份,使得二活菌素的产量达到274 mg/L,比对照组高出63%。然后,pH的变化直接反映细胞的代谢变化。通过分析5 L反应器发酵过程时序变化发现,pH变化与二活菌素的合成密切相关,当发酵液pH降为4.8时,利用NaOH将其控制在5.2～5.5,使二活菌素产量提高了103%,在此基础之上,提出了pH-前体联合调控策略：将总量为6.00 mmol/L的丁二酸钠平均分成6等份,当发酵至pH为4.8时开始补加丁二酸钠,然后每隔12 h补加一等份,利用0.50 mol/L的HC1和NaOH将发酵液pH维持在5.2～5.5,使二活菌素产量达到291 mg/L,较单独调控pH提高了108%。考虑到发酵后期葡萄糖耗尽,菌体呈碳源饥饿状态,进一步提出了pH-前体-葡萄糖联合调控策略：在pH-前体最佳调控策略的基础上,当发酵至72 h时,一次补加15 g/L的葡萄糖,使二活菌素产量达到343 mg/L,进一步提高了18%。再者,通过分析二活菌素的生物合成机制发现,基因nons的表达产物能够催化琥珀酰-CoA上的四个碳原子形成二活菌素中的四氢呋喃环,胞内琥珀酰-CoA可以通过外源添加丁二酸钠获得。因此,进一步构建了nons过表达菌株,获到了一株高产菌Streptomyces sp. R-527F-N1,其在摇瓶中的最大产量比野生株提高了59%,将该高产菌株在工艺条件优化好的5 L生物反应器上进行培养得到二活菌素最高产量为382 mg/L,较野生株在相同条件下(343mg/L)提高了11%。