1.研究背景DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学修饰(epigenetic modification)在基因转录调节过程起着重要作用,是肿瘤发生发展过程中重要的分子事件,是近年来生命科学的热门研究领域之一,其中DNA甲基化是研究得最为广泛的表观遗传学修饰。DNA甲基化过程为在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的作用下,以共价结合的方式给基因组CpG岛中胞嘧啶添加甲基基团的过程。正常的基因组甲基化模式(DNA methylation pattern)保证了细胞进行精确的基因转录调节,后者对于细胞正常功能的发挥起至关重要的作用。然而在基因转录调节过程,DNA甲基化并不是唯一起决定性作用的表观遗传学修饰,众多研究已经表明,DNA甲基化后的甲基结合蛋白(methyl-CpG binding domain protein, MBD)介导的组蛋白修饰在基因转录过程可能发挥的作用比DNA甲基化更为重要。MeCP2 (methyl-CpG binding protein 2)是MBD家族最重要的成员之一,也是潜在的肿瘤临床治疗靶点。大量研究表明,MeCP2是一个多功能基因,而这些功能绝大多数是通过对其他基因的转录调节而实现的。自MeCP2发现以来,绝大多数的研究认为其是一个抑制基因转录调节的因子。但是最近研究表明,MeCP2也能激活基因转录。然而,目前证实的被MeCP2激活的基因绝大多数是与Rett综合征(Rett syndrome)有关,未见关于其在环境致癌物等方面的研究。苯是一种常见的环境污染物和重要的工业溶剂,是一种全球用量极大的环境致癌物,其过量暴露和急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)发病风险升高有关。氢醌(hydroquinone, HQ)是苯的重要代谢产物,是一种具有血液毒性的毒物,长期、过量暴露于HQ能引起贫血、白血病等血液疾病,由于不需活化即有生物学活性,是苯的常用体外研究替代物。HQ可以引起各种各样的生物学改变,包括遗传学和表观遗传学改变,如DNA损伤,组蛋白修饰等。MeCP2表达异常在各种肿瘤组织和细胞中非常常见,且普遍为高表达。国内外而关于毒物对MeCP2表达的影响研究非常少。我们前期研究发现,MeCP2表达在HQ处理细胞、HQ诱导恶性转化细胞中呈现出动态变化,且Rb表达与MeCP2的表达在不同时间点的相关关系一直保持不变,提示Rb很有可能受MeCP2的正性调节。Rb基因(retinoblastoma gene)是肿瘤临床治疗靶点,Rb的功能涉及细胞凋亡和衰老、细胞增殖、细胞周期、应对DNA损伤和维持基因组稳定,同时研究表明,Rb表达异常在肿瘤的发生发展过程也起非常重要的作用,但其异常表达的机制尚不清晰。MeCP2的功能和Rb的功能极为相似,表明MeCP2调节Rb转录的可能性非常高。此外,生物信息学分析结果表明,Rb启动子区CpG岛内含有25个MeCP2结合位点。综上,前期研究结果、生物信息学分析结果和前人关于Rb和MeCP2功能研究结果,我们提出假设：HQ诱发的癌变过程中,MeCP2与Rb之间很可能存在正调控环,该调控环使MeCP2和Rb在HQ诱导的癌变进程中,表达量越来越低以致其沉默,其中表观遗传学改变在此过程发挥重要作用。为证实该假设开展了本研究。2.研究方法2.1.细胞及HQ剂量选择使用TK6淋巴母细胞进行本研究,遵循两个原则：(1)细胞染毒后能观察到HQ对细胞有一定的毒性,但细胞活力不能小于75%；(2)我国涉苯行业苯的实际接触水平。2.2.细胞生物学性状检测以细胞计数法和CCK-8试剂盒检测恶性转化细胞的生长速度。细胞固定后,以PI标记,用流式细胞术检测细胞周期分布情况。使用PI和FITC的双标记法进行细胞标记,流式细胞术对细胞的凋亡情况进行分析。2.3.化学物处理使用DNMT甲基转移酶抑制剂(5-AZA)、组蛋白乙酰化酶抑制剂(TSA)或DNA损伤诱导剂DOX处理细胞,24 h后收集细胞并进行相关检测。2.4.基因表达水平检测使用TRIzol试剂提取细胞RNA,进行反转录,用SYBR Green定量RT-PCR检测细胞mRNA表达水平。使用细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,Western blotting检测相关蛋白表达水平。细胞用甲醇固定后,使用间接免疫荧光流式细胞术检测Rb和MeCP2蛋白表达。2.5.甲基化特异性PCR检测基因启动子DNA甲基化水平在UCSC数据库调取基因启动子DNA序列,使用nethyl primer express甲基化特异性PCR引物设计软件设计引物。使用试剂盒提取细胞基因组DNA后,使用基因组DNA进行CpG修饰。使用PCR方法检测启动子区DNA甲基化水平。2.6.生物信息学分析从UCSC调取Rb启动子区DNA序列,查阅相关文献并使用consite等软件预测MeCP2结合位点。2.7.染色质免疫共沉淀(ChIP)检测启动子区蛋白结合情况设计PCR引物,细胞使用1%甲醛交联后,提取细胞核,超声和核酶处理细胞核。使用chip级别抗体进行染色质沉淀,对染色质进行纯化,使用实时荧光定量PCR方法对沉淀染色质含量进行检查。2.8.慢病毒MeCP2表达载体构建及稳定表达细胞构建使用基因克隆的方法将MeCP2的CDS克隆至Plvx-puro真核表达载体,使用慢病毒进行包装并感染细胞,感染后的细胞使用嘌呤霉素进行筛选,获得稳定表达细胞后用Western blotting对MeCP2表达量进行鉴定。2.9.Co-IP检测MeCP2/Rb蛋白复合体RIPA裂解液裂解细胞后,调整蛋白浓度使每个样品蛋白浓度一致,按500μg抗体加入抗体,4℃摇床过夜,加入琼脂糖珠,4℃摇床1h,收集上清,使用细胞裂解液洗涤3次,加入SDS上样缓冲液,沸水浴变性5 mmin,进行western blotting检测。3.研究结果3.1.染毒剂量的选择HQ剂量选择遵循以下两个原则：(1)细胞染毒后能观察到HQ对细胞有一定的毒性,但细胞活力不能小于75%；(2)我国涉苯行业苯的实际接触水平。因此HQ剂量选择为0～20.0分μmol/L3.2.恶性转化细胞生长速度检测细胞计数法检测结果显示,细胞培养72 h后,HQ恶性转化细胞的生长速度是PBS正常细胞生长的3.85倍,差异有统计学意义(P<0.05),CCK-8细胞活力检测试剂盒进一步证实了细胞计数结果。结果表明,HQ处理细胞已经初步具有肿瘤恶性特征。3.3.恶性转化细胞周期和凋亡改变恶性转化细胞S期细胞比例比正常细胞增多,由正常细胞的41.1%上升为48.2%,差异有统计学意义(P<0.05)。PI和FITC的双标记法流式细胞术结果表明,两种细胞的凋亡率差异没有显著性(P>0.05),但经无血清培养诱导后,差异有统计学意义(P<0.05)。3.4. RB、PTEN、p53、TPOR、H-RAS和miR-223在恶性转化细胞中的表达RT-PCR方法检测Rb、PTEN、p53、TPOR和H-RAS五个基因的mRNA及miR-223的表达水平,与正常细胞相比,Rb和PTEN的mRNA表达量在恶性转化细胞中的表达水平下降,分别是正常细胞的0.61和0.49倍,而TPOR、H-RAS和miR-223的表达水上升,分别为为正常细胞的1.91、1.73和2.36倍,差异均有统计学意义(P<0.05),而p53基因mRNA表达量无明显改变。western blotting结果显示,Rb、PTEN、TPO R和H-RAS基因的表达水平与RT-PCR的结果相一致,但是P53蛋白的表达量比正常细胞低。3.5.5-AZA和TSA处理对恶性转化细胞Rb和TPOR表达水平的影响DNMT抑制剂5-AZA和去乙酰化酶(HDAC)抑制剂TSA处理恶性转化细胞,5-AZA可使Rb基因的mR.NA表达水平恢复至正常,对p53和PTEN基因的mRNA表达没有影响,然而可使TPOR的mRNA表达水平较恶性转化细胞的上升得更高。TSA处理组,Rb和TPOR基因的mRNA表达水平与5-AZA处理的结果相似,p53和PTEN基因的表达水平没有受到影响。western blotting结果显示Rb的蛋白表达水平和RT-PCR的结果一致,但是TPOR的结果与RT-PCR的结果相反,5-AZA和TSA处理后,TPOR蛋白的表达没有上升,反而下降。3.6.5-AZA和TSA处理对恶性转化细胞生物学性状的影响5-AZA和TSA处理均可降低恶性转化细胞的细胞活力,其细胞活力分别是未处理组的49.1%和43.1%,差异有统计学意义(P<0.05),同时细胞周期阻滞于G1期,5-AZA和TSA处理细胞G1比例分别由对照组的37.5%上升到60.8%(P<0.05)和70.3%(p<0.05),细胞凋亡率也显著提高,分别由对照组的10.4%上升到23.8%(P<0.05)和15.1%(P<0.05)。3.7. RB、DNMTs、MBDs在HlQ处理细胞和HQ恶性转化细胞中的动态表达RT-PCR结果显示细胞经过HQ处理48 h后,与对照组细胞相比,Rb基因的mRNA表达量上升,而DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1～4的mRNA表达量均比对照组的要低,且DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达随着HQ剂量的增加而减少。Western blotting结果显示,在48 h时间点,Rb、DNMT1、 DNMT3b、MBD1、MBD2和MeCP2的蛋白表达趋势mRNA表达趋势一致,而DNMT3a和MBD1蛋白表达趋势和mRNA的表达趋势相反。72 h和5w两个时间点的蛋白Rb、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2和MeCP2蛋白表达趋势仍然保持一致,其中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2和MBD2的表达趋势仍然和48 h时间点的保持一致。细胞脱离HQ处理十天后,除MBD2的表达量随着HQ的剂量增加而上升,其他基因的表达量均为随着HQ剂量的增加先增加(MBD1未检测),而后减少。总之,只有MeCP2表达趋势和Rb的表达趋势保持一致,为正相关关系。3.8.MeCP2调节Rb生物信息学预测经分析在Rb启动子区有两个CpG岛,在CpG岛内有25个MeCP2特异性结合位点,两个MBD2结合位点。3.9.Rb启动子区DNA甲基化及MECP2结合情况检测提取用HQ处理5w并脱离处理10天的细胞DNA进行MSP检测,结果表明,Rb启动子区DNA甲基化程度先随着HQ剂量的增加而降低,而后又上升。10μM HQ处理5w后Rb启动子区MeCP2结合率显著升高,为PBS组的4.54倍,差异有统计学意义(P<0.05)。3.10.5-AZA和TSA处理对MeCP2和MBD2表达水平的影响5-AZA和TSA处理能恢复HQ恶性转化细胞的MeCP2表达水平,与HQ恶性转化细胞相比,表达水平上升,而MBD2的表达水平经TSA处理后下降,5-AZA处理无显著性影响。3.11.Rb蛋白与MeCP2蛋白形成蛋白复合体CO-IP结果表明,Rb蛋白和MeCP2蛋白之间能形成蛋白复合体。3.12.MeCP2基因恢复对恶性转化细胞Rb基因表达的恢复与GFP空载体细胞相比,MeCP2表达载体细胞的MeCP2的mRNA表达水平上升6.25倍,western blotting检测结果得到一致的结果。Rb的表达水平和MeCP2的相一致,表明MeCP2能激活Rb表达。3.13.Rb调控MeCP2基因表达DOX处理可激活恶性转化细胞Rb蛋白的表达,同时伴有MeCP2蛋白表达的上升。4.结论4.1.DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1和MBD2在HQ处理的TK6细胞及其恶性转化细胞中的表达出现异常,TPOR、H-RAS、PTEN、p53和miR-223在恶性转化细胞中的表达也出现异常。4.2.Rb和MeCP2表达在恶性转化细胞中的表达为下调,在HQ处理的非恶性转化细胞中的表达为上调,二者的表达始终保持相同趋势。4.3.MeCP2和Rb之间存在正调控环,该调控环的沉默在HQ诱发的肿瘤发生过程发挥重要的生物学作用。4.4.表观遗传学机制在HQ介导的MeCP2/Rb正调控环沉默过程中发挥重要作用。