【摘 要】
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本研究根据超抗原和细胞因子的各自特性,构建成新型融合蛋白质即细胞生长因子-超抗原融合蛋白质,并研究了其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达以及真核表达。（1）根据Genebank报道的VEGF （NM-003376）、SEA（A28664）基因序列,对密码子进行优化,由TaKaRa公司合成含BamHⅠ、Hind酶切位点的VEGF-pMD18-T simple和含XhoⅠ、HindⅢ酶切位点的SEA
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本研究根据超抗原和细胞因子的各自特性,构建成新型融合蛋白质即细胞生长因子-超抗原融合蛋白质,并研究了其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达以及真核表达。（1）根据Genebank报道的VEGF （NM-003376）、SEA（A28664）基因序列,对密码子进行优化,由TaKaRa公司合成含BamHⅠ、Hind酶切位点的VEGF-pMD18-T simple和含XhoⅠ、HindⅢ酶切位点的SEA-pMD18-T simple质粒,SEA前面加Linker。（2）选用pET40b作为表达载体,将SEA和VEGF基因片段依次连接至质粒pET40b中,构建重组质粒pET40b-VEGF-SEA。重组质粒经菌落PCR、双酶切鉴定以及序列分析,证明重组表达质粒pET40b-VEGF-SEA构建成功。（3）从pET40b-VEGF-SEAⅢ上切下VEGF-SEA片段,将序列确认正确的VEGF-SEA基因片段克隆至表达载体pET22b,经过菌落PCR、双酶切鉴定以及序列分析,表明重组质粒pET22b-VEGF-SEA构建成功。（4）将两种表达载体均转化大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达,通过调整参数,对影响诱导效果的诱导物浓度和诱导时间进行探索,确定最佳诱导条件为：IPTG终浓度1 mmol/L,于25℃培养4h。（5）表达产物经SDS-PAGE分析蛋白条带与预期一致,证明融合蛋白原核表达成功。融合蛋白在宿主菌中以包涵体的形式表达,表达量约占总蛋白量的30%。（6）对包涵体进行洗涤、变性与透析复性,复性回收率达60%。将透析后得到的溶液用His·Bind buffer kit试剂盒进行纯化。蛋白产物经纯化,纯度达到90%。（7）构建重组质粒pEGFP-Nl-VEGF-SEA,用脂质体转染法转入乳腺癌细胞MCF-7。获得了目的基因的真核表达,并能观察到荧光。用G418筛选出稳定转染细胞并分离出单克隆细胞株。
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