龙胆多糖的制备及生物活性分析

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采用水提醇沉法提取龙胆中的多糖成分,分别考察了提取温度、提取时间、提取次数、液料比等单因素对龙胆粗多糖(GSCP)提取率的影响。在单因素实验基础上,结合响应面设计法优化了多糖的最适提取工艺条件如下:提取温度100℃,料液比1:26.56,提取时间3h,提取次数2次。此条件下,龙胆粗多糖的实验提取率为13.0%±0.25%,响应面实验确定的多糖的提取率预测值为13.04%,预测值与验证值吻合较好。进一步采用低温反复冻融、蛋白酶E水解结合Sevag试剂萃取法除去龙胆粗多糖(GSCP)中的蛋白质杂质,得到龙胆多糖(GSP)。进而采用DEAE-Cellulose DE-52阴离子交换层析对GSP分级纯化,获得了水洗多糖组分GSP I和盐洗多糖组分GSP II。进一步采用Sepharose CL-6B凝胶层析对GSP I和GSP II进行分离纯化,结果显示上述两个组分各种又可分为三个组分,最终收集多糖含量较高的组分GSP I-a和GSP II-b。GSP I-a和GSP II-b经红外光谱分析和280nm紫外吸收检测,发现GSP I-a和GSP II-b为蛋白结合多糖。单糖组成分析显示,GSP I-a的单糖组成比例为:果糖(Fru):甘露糖(Man):鼠李糖(Rha):半乳糖醛酸(GalUA):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal):岩藻糖(Fuc)=2.2:71.9:1:14:73.8:3:8.3;GSPII-b的单糖组成比例为:Fru:Man:Rha:GalUA:Glc:Gal:Fuc=2.7:64.3:1:7.2:57.3:3.2:7。1HNMR和13CNMR分析结果表明,GSP I-a同时具有α糖苷键构型和β糖苷键构型,GSPII-b为蛋白结合多糖,且为α-吡喃糖苷构型。核磁分析也进一步验证了单糖组成的测定结果。最后对龙胆多糖进行体外抗氧化活性和体内抗肿瘤活性的研究。结果显示:GSP和GSP II-b对DPPH自由基均具有的较高的清除能力。EC50值较低,即在较低浓度下就能达到较好的清除DPPH自由基的能力,说明在组成GSP多糖组分中GSP II-b起着清除DPPH自由基的主要作用。研究中也发现龙胆多糖对超氧自由基和羟基自由基的清除能力不佳,总还原力也较低。在体内抗肿瘤研究中发现,龙胆多糖GSP有明显的体内抗肿瘤活性。
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