背景：中间丝是哺乳动物细胞骨架的重要组成部分，是一个蛋白多基因家族。根据免疫生化特性及其在不同类型细胞中的特异性表达可将其分为五大类，细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）是其中的一个大类，主要在上皮细胞表达，包括至少20种不同的成员，在不同类型的上皮细胞及上皮细胞的不同分化阶段，细胞角蛋白的表达及组合呈现组织特异性。根据理化性质的不同，细胞角蛋白又可分为Ⅰ型细胞角蛋白（CK9～20，呈碱性）和Ⅱ型细胞角蛋白（CK1～8，呈酸性）。CK20是Moll等1990年从人小肠粘膜上皮细胞中分离鉴定的，众多的免疫组化研究表明，CK20主要表达在人类胃肠道上皮细胞、胰胆管系统上皮细胞、皮肤Merkel细胞及一些肿瘤细胞如膀胱移行细胞癌（TCC）等处，由于CK20在正常细胞及肿瘤中的限制性表达方式，而迅速被应用于肿瘤细胞类型鉴别、癌症检测和围手术期肿瘤扩散监测等方面。Klein等研究表明，尽管恶性细胞通常保持原始正常细胞的中间丝表达方式，但正常尿脱落细胞并不表达CK20基因。这些发现为从TCC患者尿脱落细胞中检测CK20基因进行TCC诊断提供了可能。然而Southgate等对正常人尿脱落细胞是否表达CK20基因提出了异议，他们认为正常人、良性肿瘤患者和恶性肿瘤患者尿脱落细胞都表达CK20基因，只是表达量不同而已。为了彻底了解尿脱落细胞CK20表达模式，我们利用高灵敏度的RT-PCR法和高特异性的DNA序列分析对正常人、非TCC患者和TCC患者的尿脱落细胞进行分子生物学检 测，同时利用在膀恍上皮细胞中表达的CK19作实验对照。 目的：目前TCC的术前诊断方法主要有尿脱落细胞镜检和膀耽镜法， 前者灵敏度和特异性低，而后者对受检者造成的创伤较大。本实验利用尿 液中自然脱落的细胞进行分子检测，旨在建立一种高灵敏度、高特异性、 无创伤性的TCC诊断检测技术。 材料和方法： 1．分别留取 43例经膀耽镜检查为膀腕肿瘤的术前患者和 17例健康志 愿者尿液，离心收集尿脱落细胞，迅速提取细胞中的总RNA，并逆转录 成 CDNA，设计针对 CKIg和 CK20基因的特异引物，对同一 CDNA标本 进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据不同引物的 PCR反应体系中是否含有目的扩增片段（CK20对应370hp，CK19对应 Z14bp）而初步判断实验标本的 CK19／CK20表达模式。 2；随机抽取 CK19和 CK20阳性、阴性扩增产物各2例，经初步纯化 后，按末端终止法原理作测序PCR反应，产物经纯化后以50A；聚丙烯酚胺 凝胶电泳在 ABI 377－96测序仪上作 DNA序列分析，正反测序结果比对后 得出RT。P CR产物序列。 3 将RT。P C R检测结果与肿瘤组织病理切片和膀脓镜检结果进行比 较，评价CK20 RT－PCR法检测 TCC的可行性；对正常人、非TCC和 TCC 组CK20阳性作统计分析，观察3组标本的CK20表达模式；将DNA序 列分析结果与人类CK19、CK20基因库（美国国立卫生研究院图书馆； wwwncbl·nlm·nib，gov）数据对照，验证 RTICR产物的特异性。 结果： 1．3个实验组CK19全部表达，而CK20阳性率正常人组为0％，非TCC 患者组为59％，TCC ＆者组为885％。TCC组阳性率明显高于正常人和 非 TCC组（X‘－450，P＜0005）。 2．对 CK20 RT－PCR法与病理切片、膀恍镜结果间作统计分析表明， CKZO RTPCR ＆与病理切片法在检测TCC上无显著性差异（。·L0．25．P＞ 0．50卜 CK20 RTICR法与膀肤镜法在检测 TCC上有显著性差异（X乙17．0， P＜0刀05）。若以病理结果为标准，CK20法检测TCC特异性（97、l％）明 显高于膀肌镜法（53．l0）。 3 在膀肌镜初诊为膀肌肿瘤的43例标本中，CK20检出率与肿瘤数 目禾月 瘤病灶大小无相关性（分别为X乙0．077。P＞0，50和X‘－0、0I6，P＞ 0．99）。在病理结果证实为TCC的26例标本中，有3例标本CK20阴性 （分别为 TCC。，11、TCC 11－Ill和 TCClll各 1例），由于不同分化等级分 2组后例数少，无法进行有效统计分析，故无法验证CK20检出率与肿瘤分化等级之间的相关性。 4．RT－PCR扩增产物DNA序列分析结果与人类CK19、CK20基因序列相符，证实了该检验方法的准确性。 结论： l、实验表明绝大部分正常人和非TCC 患者尿脱落细胞表型为CK19（＋）／CK20（一，而大部 分Coo 患 者尿脱落细 胞表型 为CK19（）／CK20（＋）。CK20 的表达与肿瘤的大小、数目无关，仅与肿瘤的恶变有关。 ＊ CK20 RTPCR法检测 TCC灵敏度和特异性较高，优于膀耽镜法，且无创伤性，是一种TCC筛查和术后复查的新型检测技术。