背景胸腹部肿瘤放射治疗时,位于纵隔的心脏不可避免受到照射而引起的心脏损伤,称为放射性心脏疾病(radiation-induced heart disease, RIHD)。RIHD是胸部肿瘤放疗后最常见的良性致死原因,其发生率呈上升趋势,该病逐渐成为医学研究热点。RIHD的主要病理改变是纤维化,心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)是心脏纤维化的主要效应细胞,可合成分泌TGF-β1和胶原蛋白,二者直接参与纤维化病理发展过程,现普遍认为“纤维化”是细胞因子表达失衡的多因素复杂疾病。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是细胞内负责蛋白质合成、加工的细胞器,在受到氧化应激等因素刺激时,其内稳机制被破坏引起ER应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)反应。越来越多的证据表明ERS参与心脏的纤维化重构,但是否也参与放射性心脏纤维化损伤不清楚。总体来说,RIHD的发病机理不清,临床尚无可靠治疗措施,通常以预防为主,按照循证医学“有证查证用证,无证创证用证”的观点分析,目前RIHD的临床防治处于“无证”或“少证”阶段,这就要求在“查证”基础上进行“创证用证”实践,深入研究放射性心脏纤维化损伤的病理学分子机制,为其临床防治寻找可能的干预靶点,这具有迫切的现实意义。中药黄芪在肝、肾、肺等器官的纤维化防治中疗效明确,在RIHD的临床实践中也已见个别报道,但其改善心脏放射性纤维化的机制不清,有待进一步研究。目的(1)观察“X线对CFs的促纤维化损伤效应”并构建纤维化损伤的细胞模型；(2)在上述细胞模型上检测分析X线对84个纤维化相关分子表达的影响,筛选出差异表达的基因,从分子水平初步探索放射促纤维化损伤的可能分子机制；(3)由于ER应激可能参与心脏的纤维化重构,故观察X线是否引起CFs中FR应激反应,并通过ER应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(tauro ursodesoxy cholic acid, TUDCA)的实验干预论证ER应激与射线促纤维化损伤的关系；(4)观察黄芪对X线促纤维化损伤效应的影响,论证其对受照射CFs是否有保护作用,并从纤维化相关分子表达和ER应激两个方面探讨黄芪保护作用的可能机制,为其临床防治RIHD提供基础理论支持。方法(1)观察X线的“促纤维化损伤效应”并构建细胞模型：用低剂量X线照射CFs后,通过MTT检测细胞增殖活性,选择实验指标观察时点；通过ELISA观察纤维化指标TGF-β1、I型胶原(Col-1)和Ⅲ型胶原(Col-3)的分泌情况,粗筛造模剂量,最后用RT-PCR和Western Blot技术进一步确定造模剂量并验证“促纤维化损伤”细胞造模是否成功；(2)应用RT-PCR和微阵列相结合的实验新技术"PCR Array"高通量检测84个纤维化相关分子在对照组和模型组之间的差异表达,筛选出两组间表达变化≥2倍,有统计学差异的基因,初步分析并探讨放射促纤维化损伤的可能分子机制；(3)ER应激在射线促纤维化损伤中的作用：首先用透射电镜观察受照射CFs纤维化损伤模型中ER形态变化,然后用RT-PCR和Western Blot比较照射组和未照射组ERS标志分子GRP78、ATF6、p-PERK和CHOP的表达；最后用ERS抑制剂TUDCA预处理受照射CFs,再观察比较纤维化和ERS的标志分子差异表达的情况；(4)黄芪实验干预：通过MTT确定黄芪注射液干预剂量,黄芪注射液预处理受照射CFs,流式细胞术检测黄芪对受照射CFs中ROS的影响；以RT-PCR和Western Blot方法观察未照射组、照射组、高/低剂量黄芪+照射组中纤维化和ERS的标志分子差异表达情况；PCR Array检测84个纤维化相关分子在照射组、黄芪+照射组之间的差异表达。结果(1)Ⅹ线照射CFs发现Ⅹ线以剂量和时间依赖性方式抑制细胞增殖活性,表现出射线直接照射细胞的损伤效应。低剂量(1、2Gy)X线照射后的前48h CFs增殖活性良好,对比未照射组无差异,之后增殖变慢,和未照射组比有显著差异；同时48h观察到TGF-β1的mRNA表达分别增加了138.64%(1Gy)和88.03%(2Gy)(均P<0.D1)；Col-1的mRNA表达分别增加了109.65%(1Gy)和80.62%(2Gy)(均P<0.01)；相应的与对照组相比,蛋白TGF-β1的相对表达水平增加到160.05%(1Gy)和98.95%(2Gy),蛋白Col-1的相对表达水平增加到201.37%(1Gy)和129.54%(2Gy)(均P<0.01)。4Gy照射后,TGF-β1和Col-1的mRNA和蛋白表达均显著低于对照组。提示1、2Gy对CFs有明显的促纤维化效应。当剂量增大到4Gy,各观察时点细胞增殖抑制均显著,且上述促纤维化效应明显被取消,提示射线剂量过大,细胞活性功能全面下降。1、2Gy X线照射CFs后48h细胞活性良好,同时促纤维化效应最明显,确定为X线促纤维化损伤效应的建模剂量及观察时点。(2) PCR Array检测84个纤维化相关分子显示模型组(1Gy)和对照组(0Gy)相比有44个基因差异表达,30个基因表达上调,14个基因表达下调；细胞外基质两个基因Col-1A2和Col-3A1表达均上调；重构酶基因中MMP14、MMP3、 MMP8、Plau (uPA)、Serpinala (al-antitrypsin)表达上调,Lox、Plat、Serpinel、 TIMP1表达下调,炎性细胞因子/趋化因子类基因中CXCR4、IL-10, IL-13、 IL-13ra2、IL-1a、IL-1b、TNF表达上调,Ccr2表达下调；TGF-β超家族基因中BMP7、Cavl、Dcn、TGFβ1、Smad2、Smad3、Smad4、TGIF1表达上调,Eng、 Inhbe、Smad7、TGFβr1、Thbs1表达下调；Fasl基因表达也上调了2.1倍。(3)受照射的CFs中内质网增殖、扩张、排列紊乱。ERS标志分子GRP78和CHOP的mRNA分别较0Gy对照组增加了158.66%(1Gy)、133.12%(2Gy)和106.23%(1Gy)、189.65%(2Gy)(均P<0.01),4Gy时两者mRNA表达均下降；类似的对比0Gy组,1和2Gy照射组GRP78蛋白表达分别增加了1.50倍和1.45倍,CHOP蛋白表达分别增加了2.50倍和2.81倍,ATF6蛋白表达分别增加了70.27%和23.74%,p-PERK蛋白表达分别增加了42.9%和28.6%(均P<0.01)；以上结果提示ERS在受照射的CFs中被激活。ERS抑制剂TUDCA (0.8mmol/L)明显抑制射线诱导的ERS反应,表现为：1Gy+TUDCA组与1Gy组相比,GRP78和CHOP的mRNA表达分别降低了40.8%和42.46%(均P<0.01)；GRP78、 CHOP、ATF6和p-PERK蛋白表达分别降低了54.02%、68.01%、10.83%和22.2%(均P<0.01)；同时TUDCA下调纤维化分子的表达,减弱X线促纤维化效应,表现为：对比1Gy组,TUDCA预处理组Col-1的mRNA和蛋白表达分别下降了34.20%和64.01%分别(均P<0.01),TGF-β1mRNA的表达下降了52.76%(P<0.01),TGF-β1和其下游分子p-Smad2/3的相对蛋白质含量也分别下降了60.86%(P<0.01)和55.73%(P<001)。(4)黄芪注射液(AST)抑制受照射CFs内的ROS水平,同时AST(20μg/ml)预处理组对比单纯1Gy照射组,GRP78、CHOP、TGF-β1和Col-1的mRNA表达分别降低了40.8%、42.46%、48.12%和39.22%(均P<0.01),蛋白表达分别降低了54.02%、68.01%、48.14%和64.02%,p-Smad2/3蛋白表达降低了38.20%(均P<0.01)；AST对纤维化分子的抑制效应类似与对ROS的抑制,表现为剂量依赖性,即：20μg/ml的AST抑制作用强于10μg/ml的AST; PCR Array检测表明20pg/ml的AST预处理受照射CFs后,绝大部分差异表达的纤维化相关基因被逆转,即：射线引起高表达的基因可被AST下调,反之,射线引起表达下调的基因可部分的被AST恢复至基线水平或上调。结论(1)1、2Gy X线照射CFs后48h细胞活性良好,同时纤维化主要分子TGF-β1和Col-1表达显著增加,促纤维化效应最明显,确定为X线促纤维化损伤的建模剂量及指标观察时点；(2)小剂量X线照射CFs有明确的促纤维化损伤效应,这种效应是多途径多分子共同介导的,主要涉及的分子机制包括：促纤维化和抗纤维化失衡；TGF-β信号级联反应激活,其正性调节被强化而负性调节被抑制；细胞外基质合成增多；促炎因子/趋化因子和基质重构系统等在X线照射早期也被激活。(3)ERS也在受照射的CFs中被激活,ERS抑制剂TUDCA显著抑制X线促纤维化效应,提示ERS参与放射诱导的促纤维化损伤过程。(4)本研究显示中药黄芪可通过其抗氧化特性抑制射线诱导的ERS反应,减弱放射促纤维化损伤效应,逆转射线引起的绝大多数纤维化相关分子的异常表达而有效的保护受照射CFs。体外研究证据支持黄芪应用于放射诱导的纤维化损伤防治,但这仅仅是一个初步探索性实验,其有效性和确切分子机制有待进一步研究。