论文部分内容阅读
目的
1.采用包括生物信息学和系统生物学方法在内的综合方式，对临床疗效确切的清火柔肝方进行网络药理学分析研究，揭示清火柔肝方活性化合物的作用靶点，明确药物-基因-靶点-疾病网络关系并对葡萄膜炎治疗的治疗靶点进行富集分析。
2．构建实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)大鼠模型，通过实验验证清火柔肝方对葡萄膜炎过程的抑制作用并探索清火柔肝方可能的抗炎机制。
方法
1.采用网络药理学分析法将清火柔肝方(Qinghuo Rougan Formula, QHRGF)的十种草药分别导入中药系统药理学数据库(TCMSP)查询相应的生物活性化合物，草药成分目标数据库引入(HIT)和中药综合数据库(TCMID)。根据计算机模拟ADME(吸收分布代谢排泄)综合模型，将OB(口服生物利用度)和DL(药物相似度)用于候选活性成分筛选。化合物的结构在PubChem数据库中找到。之后，对应于从Pharmmapper数据库和PubMed数据库筛选的化合物的目标蛋白质在Uniprot中标准化。最后，收集Cytoscape3.6.0软件并构建化合物-靶蛋白网络。葡萄膜炎相关目标从OMIM数据库,DisGeNET数据库和GeneCards数据库中检索得到。删除重复靶标后，使用bioconductor包在R语言环境中对所有疾病基因靶标进行归一化。使用VennDiagram包将前面得到两套目标清单(药物相关基因和疾病目标)在R环境中过滤，筛选出了药物-疾病交叉基因。使用String11.0数据库分析交叉点的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，并在R环境中计算共同目标。最后，使用Cytoscape3.6.0用于构建“药物-化合物-靶点-疾病”的关系网络。
2.应用交叉表达的蛋白质在R环境中使用bioconductor包进行生物信息学注释，包括GO注释数据库网站，KEGG途径富集分析。
3.随机挑选6~8周龄雌性Lewis大鼠，随机分为4组(即正常对照组、EAU组、清火柔肝方常规剂量组和清火柔肝方高剂量组)，每组16只。其中EAU组大鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP1177-1191)、完全弗氏佐剂(CFA)、结合菌素(TB)和PBS300μl乳糜液以诱导EAU模型；正常对照组大鼠相同部位注射等量不含IRBP的乳化液。免疫后每天用Genesis-D眼部照相机观察EAU大鼠眼部炎症变化，并进行临床评分。当EAU大鼠在第13天达到炎症高峰期时，麻醉处死大鼠，摘取各组大鼠眼球分别进行HE病理染色，比较各组大鼠眼组织病理学差异。
4.分别于免疫后0、7、13、18天处死大鼠，摘取肝脏提取单细胞悬液，并用Ficoll密度梯度离心法分离纯化T淋巴细胞，通过流式细胞仪检测NKT、Th1、Th17细胞的动态比例变化；采用实时荧光定量PCR技术和ELISA检测免疫后第13天各组大鼠肝脏中IL-17、IL-10、IFN-γ和IL-4mRNA的表达；通过免疫组织化学染色检查和蛋白质印迹分析来检测各组大鼠肝脏中的p38，JNK，ERK1/2和p-p38，p-ERK1/2，p-JNK蛋白的表达和亚细胞定位。
结果
1.根据筛选条件，本研究收集了来自清火柔肝方的10种草药的100种化合物，去除重复后共得到80种化合物。本研究同时收集到3589种靶点蛋白，筛选关键节点并去除重复后共得到1938种靶点蛋白。从构建的成分靶点网络中可以得到清火柔肝方与1932个靶点存在关系，这些靶点之间的节点联系可以多达30774种。为了明确葡萄膜炎的靶点目标，本研究从OMIM、DisGeNET和GeneCards数据库中共检索到729种疾病目标靶蛋白，并通过筛选得到关键节点649个。利用R语言环境分析，得到的交集共同作用蛋白共259个，同时构建了“清火柔肝方-化合物-靶点-葡萄膜炎”的交互网络
2.GO注释显示药物-疾病的表达蛋白主要与细胞因子受体结合、趋化因子活性、Toll样受体结合、急性炎症反应、MAP激酶活性和酶抑制剂活性相关(图4A)。此外，KEGG富集分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用，自然杀伤细胞介导的细胞毒性和MAPK信号通路，T细胞受体信号通路和Th17细胞分化等是清火柔肝方治疗葡萄膜炎的关键途径。同时还有多数活性分子与流感病毒、弓形体病、自身免疫性甲状腺疾病和炎症免疫信号通路蛋白相关.由此阐释了清火柔肝方可能通过抗病毒、抗炎等功效来治疗葡萄膜炎的分子机制。
3.Genesis-D动物眼部照相机观察发现免疫后EAU模型组大鼠第7天左右开始出现炎症，表现为虹膜血管轻度扩张充血，第13天炎症最重，表现为虹膜严重充血，前房重度浑浊，纤维素性渗出(积脓)，瞳孔膜闭，眼球前突等。通过对比发现，大鼠免疫后第13天，EAU模型组大鼠明显出现眼前节炎症，无论是清火柔肝方高剂量还是常规剂量干预组的炎症情况明显轻于EAU模型组，表现为虹膜血管轻度扩张充血。EAU模型组大鼠外层视网膜破坏严重有明显的炎症反应，而干预组仅有少量炎症细胞浸润，病理分级明显低于EAU模型组。
4.流式细胞分别检测各组的NKT与Th1和Th17在免疫后的动态变化，发现与正常对照组大鼠相比，EAU组的NKT细胞在免疫后第7天(炎症前期)即达高峰(P＜0.01)，而在免疫第13天与EAU组大鼠相比清火柔肝方组大鼠的NKT细胞水平显著升高(P＜0.05)。其增长趋势与Th1与Th17呈现相反态势。此外，在免疫第13d，分选NKT中的IL-4发现，与正常组相比EAU组的IL-4呈现明显的增长趋势,表明葡萄膜炎的发生迅速诱导了NKT细胞产生了大量IL-4，而清火柔肝方更刺激了NKT细胞对IL-4的分泌(P＜0.01)。RT-PCR检测发现清火柔肝方可以刺激肝脏中IL-10和IL-4mRNA出现明显的上调表达(P＜0.01)，IFN-γ及IL-17mRNA出现下调表达(P＜0.05)；ELISA检测发现，清火柔肝方干预治疗后大鼠肝脏中IFN-γ、IL-17、IL-10以及IL-4的蛋白表达与基因表达趋势是一致的。蛋白质印迹分析和IHC染色分析了清火柔肝方对MAPK信号通路调节的影响，检测了JNK，p38和ERK的磷酸化表达。结果表明，清火柔肝方通过下调p38-MAPK，ERK、JNK亚基的磷酸化来介导抗炎特性。
结论
1.基于网络药理学分析对清火柔肝方中药分子与靶蛋白的相互作用预测，并结合以生物途径为基础的实验验证是一种阐释复方中药作用机制较为有效的方法。
2.抗炎应激反应是清火柔肝方的主要生物学过程，清火柔肝方可能是通过对NKT的调节作用以及抑制MAPK信号途径来调控葡萄膜炎的发展进程。本研究为进一步探索清火柔肝方治疗葡萄膜炎的作用机制奠定了基础。
1.采用包括生物信息学和系统生物学方法在内的综合方式，对临床疗效确切的清火柔肝方进行网络药理学分析研究，揭示清火柔肝方活性化合物的作用靶点，明确药物-基因-靶点-疾病网络关系并对葡萄膜炎治疗的治疗靶点进行富集分析。
2．构建实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)大鼠模型，通过实验验证清火柔肝方对葡萄膜炎过程的抑制作用并探索清火柔肝方可能的抗炎机制。
方法
1.采用网络药理学分析法将清火柔肝方(Qinghuo Rougan Formula, QHRGF)的十种草药分别导入中药系统药理学数据库(TCMSP)查询相应的生物活性化合物，草药成分目标数据库引入(HIT)和中药综合数据库(TCMID)。根据计算机模拟ADME(吸收分布代谢排泄)综合模型，将OB(口服生物利用度)和DL(药物相似度)用于候选活性成分筛选。化合物的结构在PubChem数据库中找到。之后，对应于从Pharmmapper数据库和PubMed数据库筛选的化合物的目标蛋白质在Uniprot中标准化。最后，收集Cytoscape3.6.0软件并构建化合物-靶蛋白网络。葡萄膜炎相关目标从OMIM数据库,DisGeNET数据库和GeneCards数据库中检索得到。删除重复靶标后，使用bioconductor包在R语言环境中对所有疾病基因靶标进行归一化。使用VennDiagram包将前面得到两套目标清单(药物相关基因和疾病目标)在R环境中过滤，筛选出了药物-疾病交叉基因。使用String11.0数据库分析交叉点的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，并在R环境中计算共同目标。最后，使用Cytoscape3.6.0用于构建“药物-化合物-靶点-疾病”的关系网络。
2.应用交叉表达的蛋白质在R环境中使用bioconductor包进行生物信息学注释，包括GO注释数据库网站，KEGG途径富集分析。
3.随机挑选6~8周龄雌性Lewis大鼠，随机分为4组(即正常对照组、EAU组、清火柔肝方常规剂量组和清火柔肝方高剂量组)，每组16只。其中EAU组大鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP1177-1191)、完全弗氏佐剂(CFA)、结合菌素(TB)和PBS300μl乳糜液以诱导EAU模型；正常对照组大鼠相同部位注射等量不含IRBP的乳化液。免疫后每天用Genesis-D眼部照相机观察EAU大鼠眼部炎症变化，并进行临床评分。当EAU大鼠在第13天达到炎症高峰期时，麻醉处死大鼠，摘取各组大鼠眼球分别进行HE病理染色，比较各组大鼠眼组织病理学差异。
4.分别于免疫后0、7、13、18天处死大鼠，摘取肝脏提取单细胞悬液，并用Ficoll密度梯度离心法分离纯化T淋巴细胞，通过流式细胞仪检测NKT、Th1、Th17细胞的动态比例变化；采用实时荧光定量PCR技术和ELISA检测免疫后第13天各组大鼠肝脏中IL-17、IL-10、IFN-γ和IL-4mRNA的表达；通过免疫组织化学染色检查和蛋白质印迹分析来检测各组大鼠肝脏中的p38，JNK，ERK1/2和p-p38，p-ERK1/2，p-JNK蛋白的表达和亚细胞定位。
结果
1.根据筛选条件，本研究收集了来自清火柔肝方的10种草药的100种化合物，去除重复后共得到80种化合物。本研究同时收集到3589种靶点蛋白，筛选关键节点并去除重复后共得到1938种靶点蛋白。从构建的成分靶点网络中可以得到清火柔肝方与1932个靶点存在关系，这些靶点之间的节点联系可以多达30774种。为了明确葡萄膜炎的靶点目标，本研究从OMIM、DisGeNET和GeneCards数据库中共检索到729种疾病目标靶蛋白，并通过筛选得到关键节点649个。利用R语言环境分析，得到的交集共同作用蛋白共259个，同时构建了“清火柔肝方-化合物-靶点-葡萄膜炎”的交互网络
2.GO注释显示药物-疾病的表达蛋白主要与细胞因子受体结合、趋化因子活性、Toll样受体结合、急性炎症反应、MAP激酶活性和酶抑制剂活性相关(图4A)。此外，KEGG富集分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用，自然杀伤细胞介导的细胞毒性和MAPK信号通路，T细胞受体信号通路和Th17细胞分化等是清火柔肝方治疗葡萄膜炎的关键途径。同时还有多数活性分子与流感病毒、弓形体病、自身免疫性甲状腺疾病和炎症免疫信号通路蛋白相关.由此阐释了清火柔肝方可能通过抗病毒、抗炎等功效来治疗葡萄膜炎的分子机制。
3.Genesis-D动物眼部照相机观察发现免疫后EAU模型组大鼠第7天左右开始出现炎症，表现为虹膜血管轻度扩张充血，第13天炎症最重，表现为虹膜严重充血，前房重度浑浊，纤维素性渗出(积脓)，瞳孔膜闭，眼球前突等。通过对比发现，大鼠免疫后第13天，EAU模型组大鼠明显出现眼前节炎症，无论是清火柔肝方高剂量还是常规剂量干预组的炎症情况明显轻于EAU模型组，表现为虹膜血管轻度扩张充血。EAU模型组大鼠外层视网膜破坏严重有明显的炎症反应，而干预组仅有少量炎症细胞浸润，病理分级明显低于EAU模型组。
4.流式细胞分别检测各组的NKT与Th1和Th17在免疫后的动态变化，发现与正常对照组大鼠相比，EAU组的NKT细胞在免疫后第7天(炎症前期)即达高峰(P＜0.01)，而在免疫第13天与EAU组大鼠相比清火柔肝方组大鼠的NKT细胞水平显著升高(P＜0.05)。其增长趋势与Th1与Th17呈现相反态势。此外，在免疫第13d，分选NKT中的IL-4发现，与正常组相比EAU组的IL-4呈现明显的增长趋势,表明葡萄膜炎的发生迅速诱导了NKT细胞产生了大量IL-4，而清火柔肝方更刺激了NKT细胞对IL-4的分泌(P＜0.01)。RT-PCR检测发现清火柔肝方可以刺激肝脏中IL-10和IL-4mRNA出现明显的上调表达(P＜0.01)，IFN-γ及IL-17mRNA出现下调表达(P＜0.05)；ELISA检测发现，清火柔肝方干预治疗后大鼠肝脏中IFN-γ、IL-17、IL-10以及IL-4的蛋白表达与基因表达趋势是一致的。蛋白质印迹分析和IHC染色分析了清火柔肝方对MAPK信号通路调节的影响，检测了JNK，p38和ERK的磷酸化表达。结果表明，清火柔肝方通过下调p38-MAPK，ERK、JNK亚基的磷酸化来介导抗炎特性。
结论
1.基于网络药理学分析对清火柔肝方中药分子与靶蛋白的相互作用预测，并结合以生物途径为基础的实验验证是一种阐释复方中药作用机制较为有效的方法。
2.抗炎应激反应是清火柔肝方的主要生物学过程，清火柔肝方可能是通过对NKT的调节作用以及抑制MAPK信号途径来调控葡萄膜炎的发展进程。本研究为进一步探索清火柔肝方治疗葡萄膜炎的作用机制奠定了基础。