龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）M527是一株龟裂霉素（Rimocidin）生产菌,龟裂霉素是具有抗真菌、酵母菌及肿瘤活性的多烯大环内酯类抗生素,具有较好的应用前景。由于野生菌M527的产素水平低,难以实现龟裂霉素大规模的生物合成,本文利用核糖体工程技术筛选抗生素抗性突变株,以期获得龟裂霉素产量提高的突变株,并对相关抗性突变株的形态分化、基因表达等方面开展研究。主要研究内容如下:首先利用利福平（Rifampicin）、庆大霉素（Gentamicin）筛选获得不同类型的S.rimosus M527抗性突变株,结果表明:获得的25株Rif^r突变株中有16株的龟裂霉素产量较原始菌株M527有提高,增幅为22.3%²7.1%,其RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB基因的突变位点均为C1309G,导致相应氨基酸变化为His437Asp。筛选得到的93株Gen^r突变株多表现为遗传不稳定性或龟裂霉素产量下降的突变株,多次传代后仅有Gen^r突变株M527-G37遗传稳定性较好,其龟裂霉素产量较原始菌株M527提高34.4%。以Gen^r突变株M527-G37为出发菌株,筛选组合Gen和Rif的双重抗性突变株43株。其中Gen^r-Rif^r突变株M527-GR7的龟裂霉素产量达到399.7 mg/L,较原始菌株M527提高了74.7%。比较原始菌株M527、Gen^r突变株M527-G37及Gen^r-Rif^r突变株M527-GR7的形态特征发现,相比原始菌株M527,Gen^r突变株M527-G37有可溶性色素产生,而Gen^r-Rif^r突变株M527-GR7可溶性色素颜色更深。扫描电镜结果发现:相比原始菌株M527,Gen^r突变株M527-G37的菌丝与孢子排列整齐,形成具有空隙的网状空间结构;相比Gen^r突变株M527-G37,Gen^r-Rif^r突变株M527-GR7的菌丝与孢子的排布无规则,且产孢能力降低。其次,根据NCBI上公布的Streptomyces diastaticus var.108中合成龟裂霉素的部分基因rimA、rimB、rimC、rimD、rimE、rimF、rimG、rimH、rimJ、rimK设计引物,以S.rimosus M527的DNA为模板,成功克隆得到相应的rimA_sr^rimK_sr基因,其核苷酸序列与S.diastaticus var.108中对应的基因核苷酸序列基本一致。为探究rim基因的表达水平与龟裂霉素合成相关性,考察了菌株原始菌株M527、Gen^r突变株M527-G37及Gen^r-Rif^r突变株M527-GR7发酵48 h时的rim基因转录水平。结果表明:在Gen^r-Rif^r突变株M527-GR7和Gen^r突变株M527-G37中,rimA_sr^rimK_sr整体转录水平显著高于原始菌株M527;且rimB_sr、rimD_sr、rimE_sr及rimG_sr基因的转录水平随着龟裂霉素产量升高而升高。最后,建立并优化了S.rimosus M527的接合转移体系:供体菌ET12567（pUZ8002,pGUS-ermE^*）/受体孢子为10⁸/10⁷,受体孢子50°C热激10 min,37°C温育2-3 h,以2CMC培养基为接合转移平板,涂布后28°C培养16¹8 h覆盖终浓度为300μg/mL安普霉素和50μg/mL萘啶酮酸,最终使其接合转移效率由2.64×10^-7达到1.67×10^-5。GUS报告基因的表达不仅表明接合转移方法的有效性,同时也表明了启动子permE^*在S.rimosus M527中可以有效启动外源基因的表达。此外,分别将rimB_sr(rimD_sr、rimE_sr、rimG_sr)置于启动子permE^*的下游,构建了重组质粒pIB139-rimB_sr(rimD_sr、rimE_sr、rimG_sr),并通过接合转移法将其在S.rimosus M527中进行了过量表达得到重组菌M527-RIMB、M527-RIME、M527-RIMG。结果表明:与原始菌株相比,重组菌M527-RIMB、M527-RIME、M527-RIMG的龟裂霉素产量分别提高了95.3%、1.3倍、85.3%,而M527-RIMD的龟裂霉素产量基本不变,说明rimB_sr、rimG_sr、rimE_sr基因涉及龟裂霉素的生物合成且呈正相关。