研究背景乳腺炎是一种常见的女性乳腺疾病,临床一般分为哺乳期乳腺炎和非哺乳期乳腺炎,通常哺乳期乳腺炎多为急性感染性,近年来随着卫生条件的改善和保健意识的提高,哺乳期乳腺炎发病率有下降趋势;但既往认为发病率较低的非哺乳期乳腺炎(Non-puerperal mastitis,NPM)发病率逐年迅速上升。非哺乳期乳腺炎可发生于各年龄段的成年女性,主要影响中青年女性。导管周围乳腺炎(Periductal mastitis,PDM)和肉芽肿性小叶性乳腺炎(Granulomatous lobular mastitis,GLM)是非哺乳期乳腺炎中两种最主要的类型,其中导管周围炎占有症状的乳腺疾病的1-2%,而肉芽肿性小叶性乳腺炎相对较为少见。该类疾病起病急缓不一,部分患者进展迅速,在数天内出现红肿热痛表现,并可出现乳房脓肿甚至形成窦道,也有部分患者进展较为缓慢,仅表现为无痛性乳房肿块,同时治疗后患者病情易出现反复,迁延不愈。该类疾病在影像学上可表现为不规则低回声或混合回声肿块,在无明显炎症表现时与乳腺癌难以鉴别,同时导管周围炎与肉芽肿性小叶性乳腺炎的临床及影像学表现有相似之处,容易导致误诊误治,目前非哺乳期乳腺炎并无有效的特异性治疗措施,导致部分患者因此行乳房切除,给患者身心带来了极大的痛苦。目前非哺乳期乳腺炎的病因及危险因素尚不明确,包括吸烟、饮酒、肥胖等多种因素及生育相关因素与该病的相关性均有报道,但鉴于样本量较小、缺乏相关动物模型等原因尚无一致性的明确结论。国外研究通常认为导管周围炎与吸烟关系密切,其复发也与吸烟尤其是重度吸烟有关,但我国女性吸烟率仅为2.4%,明显低于西方国家,因此我国导管周围炎患者与吸烟的关系有待进一步研究确定。生育相关因素与导管周围炎的关系存在较多争议,一般认为包括首次足月妊娠年龄、足月妊娠次数、哺乳时长等众多因素均可能与该病相关。多数学者认为导管周围炎与细菌感染有关,包括需氧菌及厌氧菌在内的多种细菌与本病可能相关,但尚未发现与其相关的特异性的致病菌。国内外对于导管周围炎与细菌关系的研究已有报道,但细菌感染后的免疫炎症反应研究较少,导管周围炎的病因学及可能的免疫学机制认识较少。肉芽肿性小叶性乳腺炎的病因学尚不明确。肉芽肿性小叶性乳腺炎被认为是一种自身免疫相关疾病,主要与哺乳、高泌乳素血症及感染等因素相关。肉芽肿性小叶性乳腺炎通常发生于生育后5年内,与患者足月妊娠、哺乳等生育相关因素关系密切,同时包括肥胖、糖尿病等多个因素都被认为是该病的危险因素,但与吸烟关系不大。国内外对于该病与细菌感染的研究较多,细菌感染尤其是棒状杆菌与肉芽肿性小叶性乳腺炎的关系逐渐得到认可,但对其发病机制研究较少,细菌在该病中引起的免疫炎症反应无明确结论。非哺乳期乳腺炎的治疗是乳腺外科临床工作中的棘手问题。手术治疗仍是目前临床的主要治疗措施,但国内外报道均认为手术治疗并不是非哺乳期乳腺炎治疗的标准治疗措施,手术范围过小则术后复发率极高,手术范围过大,对于乳房的外观影响较大,术后因乳房变形等问题对女性心理造成较大创伤。对于导管周围炎,包括抗分枝杆菌治疗、中医中药治疗等,均有相关文献报道;而对于肉芽肿性小叶性乳腺炎,糖皮质激素治疗、抗分枝杆菌治疗等均有文献提及。基于以上背景,本研究拟通过非匹配病例对照研究分析明确该病的危险因素,同时收集非哺乳期乳腺炎患者标本进行细菌学研究及初步免疫学探讨,并总结本院抗分枝杆菌治疗的肉芽肿性小叶性乳腺炎及导管周围炎患者,进行长期随访,为该病的发病机制及治疗提供参考。第一部分 非哺乳期乳腺炎的临床相关危险因素分析研究目的本课题组前期研究显示,乳头内陷及被动吸烟是非哺乳期乳腺炎的危险因素,本研究拟通过非匹配的病例对照研究方法,采用单因素及多因素分析,深入分析导管周围炎及肉芽肿性小叶性乳腺炎的临床危险因素,主要探讨吸烟、肥胖、生育相关因素与该病的相关性,并比较导管周围炎及肉芽肿性小叶性乳腺炎临床表现、危险因素的异同,从而为该类疾病的预防、分类诊断及进一步的基础研究等提供参考。研究方法1.研究对象的选择回顾性分析2011年1月至2015年3月山东大学第二医院乳腺外科收治的共113例非哺乳期乳腺炎患者临床及病理学资料,其中PDM 87例、GLM 26例,病理学结果由2名我院病理科医师进行阅片和诊断,并排除乳腺结核、炎性乳癌等其他可能的疾病。对照组选取山东大学第二医院查体中心的健康人群,并通过乳腺专科查体及乳腺超声检查纳入无异常结节及明显导管扩张者。2.收集资料通过问卷调查形式收集病例及对照组资料,调查问卷由访谈问卷及乳腺外科临床检查表两部分组成,包括了调查对象基本信息、疾病与家族史、生活习惯;同时收集调查对象临床查体及辅助检查等资料。对问卷进行数据录入,认真核查数据。3.统计学分析本研究为非匹配的病例对照研究。所有资料整理和分析均用SPSS17.0和Excel软件分析。一般特征描述用构成比描述病例组与对照组调查对象的主要特征,计数资料采用n(%)表示,计量资料采用均数±标准差(Mean±SD)表示。采用Levene方差齐性检验,对连续性资料的方差进行检验。采用非配对t检验进行连续性资料的分析,采用卡方分析、Fisher确切概率法进行分类资料的统计分析。采用单因素条件Logistic回归分析筛选相关影响因素,计算其比值比(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidence interval,CI),取α=0.05。对纳入多因素分析的变量采用多因素非条件Logistic回归分析,分别计算具有显著性意义变量的OR值及其95%CI,取α=0.05。结果1.描述性结果本科室自2011年至2015年期间收治的PDM患者为87例,GLM患者为26例,对照组入组研究对象87例。87例PDM患者中位年龄34(20-62)岁,26例GLM患者中位年龄为29(22-44)岁,对照组中位年龄为34(26-45)岁。PDM与超重/肥胖、足月妊娠次数、首次足月妊娠年龄、初潮年龄、绝经、乳头内陷、累积哺乳时长等相关,而与婚姻状况、流产史、哺乳史、积乳史、既往良性乳腺疾病史、慢性疾病史、药物过敏史、饮酒、主动吸烟、被动吸烟、妊娠次数等无关。GLM与初潮年龄、乳头内陷、体重指数(Body mass index,BMI)相关,而与超重/肥胖、哺乳史、避孕药、绝经、既往良性乳腺病史、慢性疾病史、药物过敏史、饮酒、主动吸烟、被动吸烟、足月妊娠次数、流产史、积乳史无关。2.PDM与对照组比较的单因素及多因素Logistic回归结果2.1单因素Logistic回归结果:参考国内外文献报道的相关危险因素及临床相关因素进行单因素Logistic回归分析。超重/肥胖、初潮年龄、足月妊娠次数、既往良性乳腺病史、乳头内陷是PDM危险因素,而首次足月妊娠年龄为PDM保护因素(P<0.05)。流产史、累积哺乳时长、积乳史、药物过敏史、被动吸烟与PDM风险无关(P>0.05)。2.2多因素Logistic回归结果:将相关因素纳入多因素非条件Logistic回归分析,在校正了多个因素后,超重/肥胖(OR,1.358;95%CI,1.083-1.704;P=0.008)、初潮年龄>14 岁(OR,2.408;95%CI,1.378-4.208;P=0.002)为PDM的危险因素,而首次足月妊娠年龄>27岁(OR,0.184;95%CI,0.034-0.983;P=0.048)是 PDM 的保护因素。2.3 PDM亚组分析按照年龄35岁将病例及对照分为两组。年龄<35岁组:单因素分析结果显示,仅乳头内陷为PDM危险因素(P<0.05);对相关因素进行多因素分析显示,初潮年龄>14岁和乳头内陷是年龄小于35岁PDM患者的危险因素。年龄≥35岁组:超重/肥胖、初潮年龄、足月妊娠次数为PDM危险因素,而首次足月妊娠年龄>27岁是其保护因素(P<0.05)。多因素分析结果:初潮年龄>14岁、足月妊娠次数多为其危险因素。3.GLM与对照组比较的单因素及多因素Logistic回归结果3.1单因素Logistic回归结果单因素分析结果显示:超重/肥胖、初潮年龄、乳头内陷与GLM风险相关(P<0.05)。而足月妊娠次数、首次足月妊娠年龄、既往良性乳腺病史、流产史、哺乳史、积乳史、药物过敏史、被动吸烟与GLM风险不相关危险因素(P>0.05)。3.2多因素Logistic回归结果将相关因素纳入多因素非条件Logistic回归分析,结果显示:超重/肥胖(OR,2.934;95%CI,1.264-6.808;P=0.012)、初潮年龄>14 岁(OR,16.280;95%CI,3.268-81.093;P=0.001)及足月妊娠次数多(OR,9.450;95%CI,1.394-64.055;P=0.021)与GLM发病的危险因素相关。4.GLM与PDM在相关危险因素及临床病理表现的比较两组患者年龄具有显著差异。在BMI、初育年龄、足月妊娠次数、哺乳时长、绝经、既往慢性疾病史、积乳史、被动吸烟等方面无显著差异。PDM组与GLM组患者在发现病变至就诊时间、末次生育至发病时间、肿块大小、局部皮肤红肿及破溃/窦道形成等方面有显著差异,在首诊临床表现、发病侧别、象限、乳头乳晕区病变、乳头内陷等方面无统计学差异。同时在临床血液学检查方面,仅单核细胞绝对值两组间存在差异。两组患者病理学特征中,在中性粒细胞浸润、多核巨细胞、泡沫细胞及肉芽肿形成方面存在统计学差异,而淋巴细胞浸润无明显差异。结论1.超重/肥胖、初潮年龄>14岁为PDM的危险因素,而首次足月妊娠年龄>27岁是PDM的保护因素,并且以年龄分层后危险因素不尽相同;2.超重/肥胖、初潮年龄>14岁及足月妊娠次数多为GLM的危险因素;3.PDM与GLM在临床表现及病理特征上存在较多差异。第二部分 非哺乳期乳腺炎细菌学及Th1/Th2/Th17细胞因子表达的研究研究目的国内外研究中细菌感染可能是该病的始动因素之一,我们的前期研究中,选择2010年8月-2013年3月于我院初治新发的31例非哺乳期乳腺炎患者进行普通16S rDNA检测,结果均证实了细菌存在,多数为混合细菌感染状态,但前期研究未对正常乳腺组织进行检测和比对。本次研究通过收集良性乳腺肿瘤患者瘤旁的正常乳腺组织,进行16S rDNA检测,明确正常乳腺组织中细菌情况,进一步明确细菌在该病中的作用。国内外文献报道及本课题组前期研究结果,均证实了细菌与该病关系密切,但并未发现特异性致病菌,据此推测细菌感染后继发的免疫反应可能是该病发生发展的关键。包括肥胖、泌乳素、激素水平等多种因素均可影响免疫平衡,即出现Th1/Th2/Th17免疫平衡紊乱,各类型免疫反应即局部以某型细胞及细胞因子为主,并不局限于TTh细胞,而是多种类型的免疫反应。目前关于非哺乳期乳腺炎局部免疫平衡状态的相关研究仍较少。明确非哺乳期乳腺炎的免疫反应类型,对于了解疾病发生机制、探讨病因及指导治疗均有一定意义。研究方法1·细菌学检测纳入本科室住院治疗的初治新发的31例非哺乳期乳腺炎患者,于手术室无菌条件下收集患者新鲜组织或脓液,纳入本科室治疗的其他良性乳腺疾病患者,无菌条件下收集良性病灶旁的正常乳腺组织作为对照组,通过提取细菌基因组DNA、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳获取乳腺组织中的细菌DNA,并通过16S rDNA检测,将结果与NCBI基因数据进行比对,鉴定细菌的种属。2.免疫组化检测相关细胞因子获取病例组患者石蜡切片,经两位病理科医师复核确认,病理诊断无误后入组,病理类型分为GLM与PDM,对照为其他良性疾病的肿瘤旁正常组织,进行脱水、包埋获取石蜡标本。对入组的病例组及对照组的石蜡标本进行切片,对IL-4,IL-10,IL-12A,IL-17和IFN-y进行免疫组织化学染色。免疫组化结果由病理科医师阅片后统计分析,分为强度和范围评分。通过与对照组正常乳腺组织比较,分析PDM及GLM与与Th1/Th2/Th17细胞因子表达的关系,并比较PDM与GLM细胞因子表达的异同。3 统计学分析方法采用SPSS 17.0对所有数据进行统计分析。利用卡方检验对PDM及GLM与正常乳腺组织中的Th1/Th2/Th17细胞因子表达差异进行统计分析,检验结果取双侧,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.细菌学检测结果病例组术后病理证实均为PDM,无GLM患者样本入组,对来自31例患者的33份样本及对照组12例正常乳腺组织的进行检测。1.1 PDM与细菌感染相关提取细菌基因组DNA并进行凝胶电泳后,结果显示病例组样本经序列1(V3F,V3R)16SrDNA扩增后,出现一条约200bp大小的DNA条带,经序列2(27F,519R)16S rDNA扩增后,出一条约490bp大小的DNA片段,而对照组均未见明显条带,说明病例组患者存在细菌感染,而对照组正常乳腺组织内未检测到细菌。1.2混合细菌感染是PDM最常见感染经测序及比对分析结果发现,混合细菌12例,假单胞菌属9例,屎肠球菌2例,kroppenstedtii棒状杆菌1例,坚硬芽孢杆菌1例,芽孢八叠球菌1例,葡萄球菌1例,宏基因组文库的细菌4例。结果提示,多种细菌感染是PDM患者最常见感染,其次为假单胞菌属感染,但在检测中并未发现特异性致病菌。2.Th1/Th2/Th17细胞因子检测Th1/Th2/Th17细胞因子在正常乳腺上皮细胞、炎症间质细胞中均有表达,IFN-γ、IL-12A、IL-4、IL-10及IL-17A主要表达于细胞浆中,但在细胞核尤其是淋巴细胞细胞核中也有表达,细胞外基质中亦可见阳性表达。2.1 PDM患者Th1/Th2/Th17细胞因子表达本研究中31例PDM患者的免疫组化染色,结果显示与对照组相比,Th1相关细胞因子IFN-γ和IL-12A在PDM患者组织中表达显著高于对照组(P<0.05),而Th17细胞因子IL-17A及Th2细胞因子IL-4、IL-10与对照组比较无明显变化(P>0.05)。为比较在PDM发展过程中细胞因子的表达差异,本研究比较了病例组不同分期患者的细胞因子表达情况。31例患者中16例为肿块期患者,尚未形成脓肿,其余15例为脓肿期患者,两组间比较各细胞因子表达无差异均未达到统计学意义(P>0.05)。脓肿形成及外周血小板计数可显著影响IL-12A的表达,而外周血小板计数也可影响IFN-γ的表达。2.2 GLM患者Th1/Th2/Th17细胞因子表达本研究中26例GLM患者进行免疫组化染色,结果显示,Th1细胞因子IFN-γ和IL-12A在GLM患者组织中表达显著高于对照组(P<0.05),而Th17细胞因子IL-17A及Th2细胞因子IL-4、IL-10与对照组比较无明显变化(P>0.05)。病灶大小可显著影响IL-12A的表达,而窦道形成与IFN-y表达呈显著正相关。2.3 PDM与GLM的比较比较31例PDM与26例GLM患者免疫组化染色结果显示,Th17细胞因子IL-17A在PDM的表达显著高于GLM患者(P<0.05),其余Th1/Th2细胞因子的表达无统计学差异(P>0.05)。结论1.细菌感染尤其是混合细菌感染可能是PDM的重要病因;2.PDM患者Th1型细胞因子IFN-y及IL-12A表达明显增高,IL-4、IL-10未见明显升高,未发现各细胞因子与疾病分期呈现明显相关性。3.GLM患者IFN-y及IL-12A表达显著高于正常乳腺组织,Th2及Th17细胞因子的表达与正常组织相比无显著差异。4.与GLM患者相比,PDM患者IL-17A的表达明显增高。第三部分抗分枝杆菌治疗在非哺乳期乳腺炎中的应用研究目的非哺乳期乳腺炎的治疗是乳腺外科临床工作中的棘手问题。手术治疗仍是目前临床的主要治疗措施,但国内外报道均认为手术治疗并不是非哺乳期乳腺炎的标准治疗,手术范围过小则术后复发率极高,手术范围过大,对于乳房的外观影响较大。药物治疗的应用存在较大争议,对于PDM可给予抗分枝杆菌治疗、中医中药治疗等;而对于GLM,糖皮质激素治疗、抗分枝杆菌治疗等均有文献提及。本研究为单臂临床研究,收集总结本院治疗的GLM及PDM患者,评价抗分枝杆菌治疗在PDM及GLM中的临床应用,并进行长期随访,为临床治疗提供参考依据。研究方法1·研究对象的选择本研究纳入2011年1月-2015年3月于本科室接受抗分枝杆菌治疗的非哺乳期乳腺炎患者为研究对象。患者入院后经病理确诊为PDM及GLM,并排除乳腺结核等其他疾病,排除用药禁忌后,局部有红肿、穿刺脓液及窦道患者给予抗分枝杆菌治疗。2.资料收集方案一般资料通过第一部分中的调查问卷获取,具体方法详见第一部分研究方法。另外详细记录患者临床查体、入院前药物及手术治疗史、入院后治疗资料,并通过门诊或电话进行随访,记录患者病灶变化、监测副作用等。所有资料使用EXCEL软件建立数据库,录入过程中仔细核对信息,保证了录入的准确性。3.疗效判定标准(1)完全缓解:完成6-12个月的抗分枝杆菌治疗并停药后,临床查体及辅助检查未发现明显异常,无炎症表现,并经过停药后半年的随访无复发及新发;(2)部分缓解:患者接受治疗后病灶变小、脓液较前减少,炎症较前减轻,但未达到完全缓解标准;(3)无效:用药6个月后患者病灶无变化或发生进展、炎症加重、新发破溃或窦道形成。(4)复发或新发:抗分枝杆菌治疗后病灶痊愈,但停药后疾病反复,同侧或对侧乳腺复发或新发疾病并经病理证实为PDM或GLM。4.统计学分析将EXCEL中的数据导入SPSS软件,所有资料整理和分析均以SPSS 17.0和Excel软件分析。以构成比描述接受抗分枝杆菌治疗患者的主要特征,计数资料采用n(%)表示,计量资料采用均数±标准差(Mean±SD)或中位数(范围)表示。采用Levene方差齐性检验,对连续性资料进行方差齐性检验。结果1·描述性结果2011年-2015年于本科室住院治疗的PDM患者共计87例,其中接受抗分枝杆菌治疗患者64例,中位年龄31(22-58)岁。9例患者入院后行切开引流+二期缝合,其余55例患者接受麦默通微创切检术。40例患者有乳房局部皮肤红肿热痛等炎症表现,38例患者切检或切开时可抽出脓液,15例患者乳房局部皮肤已破溃或有窦道形成。GLM患者共计26例,22例患者接受抗结核治疗,中位年龄为29(23-44)岁;入院前10例患者未接受过任何治疗,12例患者接受抗菌药物治疗。1例患者行切开引流+二期缝合,21例患者行微创切检术,16例患者有乳房局部皮肤红肿热痛等炎症表现,12例患者切检或切开时可抽出脓液,8例患者乳房局部皮肤已破溃或有窦道形成。2.PDM抗分枝杆菌治疗效果入组的64例PDM患者,失访16例。7例因副作用放弃抗分枝杆菌治疗,1例因怀孕停药,其余40例患者接受6-12个月抗分枝杆菌治疗。停药后经过中位时间为26(10-60)个月的随访,3例患者接受半年以上抗分枝杆菌治疗后无效,1例患者药物治1年后因外伤出现复发;部分缓解的为1例,其余35例患者局部皮肤炎性改变消失、窦道均已闭合,且临床查体及影像学表现未见明显肿块,到完全缓解,有效率为87.50%(35/40)。3.GLM抗分枝杆菌治疗效果接受治疗的22例患者中,失访3例。其余19例中,无患者出现不能耐受的副作用,均接受6-12个月的抗分枝杆菌治疗。停药后经过中位时间29(11-42)个月的随访后,1例患者治疗效果欠佳,治疗无效;18例患者达到完全缓解,且未出现疾病反复、新发或复发的患者,有效率为94.74%。结论1.对于局部皮肤炎性改变、脓肿形成或窦道/破溃的导管周围炎患者,抗分枝杆菌治疗有效。2.肉芽肿性小叶性乳腺炎患者对抗分枝杆菌治疗尤为敏感,临床疗效好,可作为手术替代治疗方案。创新性及意义目前关于非哺乳期乳腺炎患者病因及临床治疗的相关研究仍较少,特别是免疫学在该病中的作用尚不明确,因此本研究通过病例对照研究及临床治疗随访对非哺乳期乳腺炎患者病因及临床治疗效果进行初步探讨,初步明确了细菌与非哺乳期乳腺炎的相关性,通过探讨两病免疫反应的异同点,对于研究GLM与PDM的发病机制及进行临床治疗方案的选择具有重要的参考价值。