背景及目的:脑胶质瘤（Glioma）是成人颅内最常见的原发性肿瘤,占成人颅内原发性恶性肿瘤的百分之七十以上,世界卫生组织（World health organization,WHO）根据其细胞异型性、核分裂活跃程度、微血管增生和坏死程度将其分为Ⅰ到Ⅳ级,Ⅰ级和Ⅱ级胶质瘤为低级别胶质瘤（Low-grade glioma,LGG）,Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤为高级别胶质瘤（High-grade glioma,HGG）。高级别胶质瘤恶性程度高,肿瘤进展快,即使治疗方法不断发展,其预后仍然很不理想,特别是WHOⅣ级胶质母细胞瘤,中位生存时间仅为14.6个月,5年生存率低于5%。高级别胶质瘤血管增生活跃,基底膜畸形、内皮不完整、周细胞缺失以及连通紊乱,形成了低氧、酸性以及高细胞间压力的特殊肿瘤微环境,刺激缺氧诱导因子（Hypoxia-Inducible factor,HIF）、促血管生成因子如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）等的分泌而进一步促进肿瘤血管新生,而且与肿瘤的生长、进展及转移密切相关。胶质瘤微血管还参与形成肿瘤血管龛（Niche）样结构,既可以为胶质瘤肿瘤干细胞的生存提供必要的场所及营养支持,又可以通过血管内皮细胞与肿瘤干细胞的相互交联促进干细胞的自我更新与干性维持,在胶质瘤的治疗抵抗以及复发中发挥关键作用。高级别胶质瘤的微血管增生在肿瘤生物学行为中发挥重要作用,抗血管治疗为胶质瘤的治疗提供了新的思路和方向。胶质瘤的血管新生是一个多基因、多分子调控的复杂过程。多种细胞因子参与其中,例如VEGF、基质细胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）、血管生成素（Angiopoietin-2,ANG-2）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）、HIF以及基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMP）等,均在肿瘤发生发展的不同阶段以及不同的病理性血管生成过程中发挥促血管新生的作用。高级别胶质瘤内存在多种形式的血管新生方式,如血管共生、血管生成、血管发生、血管拟态和肿瘤细胞内皮转分化等,不同的血管新生方式对应的病理过程以及调控机制不同,其主要调控基因既有交叉又相互独立。其中VEGF基因的高表达是胶质瘤中促进肿瘤血管新生的关键事件,参与了多种方式的血管新生,但是临床上使用放疗联合替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）化疗辅以贝伐单抗（Bevacizumab,BEV）抑制肿瘤VEGF生物活性的抗血管治疗策略并未能延长胶质瘤患者的生存时间,甚至在BEV治疗之后肿瘤区域血管共生增多且肿瘤侵袭增强,而且针对其它促血管新生分子的抗血管治疗策略在临床上也没能真正起到抗肿瘤血管新生进而抑制肿瘤生长的目的。说明尚有未知的血管新生调控基因以及抗血管治疗后血管新生方式的变化导致了胶质瘤的抗血管治疗未能达到预期的目的。由于高级别胶质瘤具有明显的异质性,手术或活检获取的部分肿瘤组织无法全面反映肿瘤的生物学特性,因此在抗血管治疗过程中尚待寻找一种能全面评价肿瘤内部血管相关基因表达以及无创监测抗血管治疗疗效的有效手段。磁共振灌注成像（Perfusion-weighted MR imaging,PWI-MRI）技术被广泛应用于无创监测肿瘤内部血流及血管情况,进而评估肿瘤的分子特征及基因表达。DSC-MRI成像技术根据血管内对比剂信号强度随时间的变化,可以获得反映肿瘤内部血流灌注的参数CBV及CBF,DCE-MRI成像技术不仅可以获取肿瘤内部血流灌注的信息,例如血浆容积V_p、血管外细胞外间隙容积V_e,而且可以获得反映肿瘤血管功能的参数,例如血管通透性指标K_trans以及对比剂反流速率指标K_ep。这些参数不仅与肿瘤区域血管的结构和功能相关,而且在一定程度上可以反映肿瘤的分子特征及基因表达。例如,K_trans与胶质母细胞瘤DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）启动子甲基化状态相关,rCBV可以用来评估胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）突变状态及MGMT启动子甲基化状态等,也有文献报道肿瘤特定信使核糖核酸（Messenger RNA,m RNA）的表达量与其磁共振成像特征相关。因此磁共振灌注成像技术可以作为无创评价肿瘤内部血管相关基因表达以及抗血管治疗后肿瘤血管新生方式变化的潜在手段。综上所述,本研究首先收集了高级别胶质瘤手术标本,提取原代肿瘤细胞建立原位小鼠肿瘤模型并对肿瘤组织进行转录组测序,根据肿瘤标本微血管状态以及能否成功构建原位胶质瘤模型,筛选出新的与高级别胶质瘤早期生长与进展密切相关的血管新生相关基因,并且筛选影像生物指标预测相关基因的表达情况,为胶质瘤抗血管治疗提供新的靶点以及检测手段。而后对比了原代小鼠原位胶质瘤模型与患者脑胶质瘤常规及灌注磁共振特征的差异,并且从组织病理学以及基因表达的角度探究造成这些差异的原因,为动物来源的磁共振生物标志的临床应用提供实验基础,最后通过BEV和TMZ单独或联合干预原位小鼠胶质瘤模型的生长,探究治疗过程中肿瘤血管新生方式的动态变化以及能反映这种变化的影像标志,从血管新生方式的角度探索抗血管治疗失败的原因,为胶质瘤的个体化精准诊断以及抗血管治疗疗效监测提供科学可靠的实验依据。材料与方法:第一部分:高级别脑胶质瘤生长早期血管新生相关基因表达与PWI-MRI监测1、收集高级别胶质瘤病例30例,术前行DSC及DCE-MRI扫描,术中取肿瘤标本。2、无菌条件下将肿瘤标本分为三部分,第一部分用来提取原代肿瘤细胞建立小鼠原位肿瘤模型;第二部用来对肿瘤血管进行组织病理学分析,定量分析肿瘤区域微血管密度（Microvessel density,MVD）,微血管面积（Microvascular area,MVA）以及平均微血管直径（Diameter）;第三部分用来进行转录组测序。3、对DSC及DCE-MRI原始图像进行后处理后获得CBV、CBF、K_trans、V_p、V_e及K_epmap,计算肿瘤所有体素平均r CBV、r CBF、K_trans、V_p、V_e及K_ep值作为该肿瘤的r CBV、r CBF、K_trans、V_p、V_e及K_ep值。4、根据原代肿瘤细胞能否在小鼠颅内生长并建立原位移植瘤模型,将30例高级别胶质瘤病例分为成瘤组与未成瘤组,比较两组病例灌注磁共振扫描参数r CBV、r CBF、K_trans、V_p、V_e和K_ep,肿瘤组织MVD、MVA和微血管直径,以及血管新生相关基因表达的差异。5、使用siRNA分别抑制两例原代肿瘤细胞内上述基因的表达,检测其成血管能力的变化。6、根据小鼠原位移植瘤生长曲线,动态监测上述基因在肿瘤不同生长阶段的表达及其与肿瘤微血管的关系。7、对两组病例之间有显著差异的磁共振扫描参数进行受试者操作特性曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）评估,获取其鉴定肿瘤组织上述基因是否高表达的诊断阈值（cut-off值）、特异性及敏感性。第二部分:原代脑胶质瘤模型与相应患者脑胶质瘤MRI特征及基因表达差异研究1、收集了高级别胶质瘤病例7例。术前均行常规MRI,DWI-MRI以及DCE-MRI扫描,术中取肿瘤标本。2、对患者DWI及DCE-MRI原始图像进行后处理后获得ADC及K_transmap,使用热点法在肿瘤最大层面上选取五个感兴趣区（Region of interest,ROI）,分别测量得到r ADC及K_trans值,计算平均值作为该病例肿瘤的r ADC及K_trans值。3、分别提取原代肿瘤干细胞球并建立相应NOD-SCID小鼠原位胶质瘤模型,每例建模5只。4、在NOD-SCID小鼠原位移植瘤生长晚期,采用Bruker 7.0T小动物磁共振成像仪头部线圈对荷瘤鼠进行扫描,扫描序列有T1WI横断位,T2WI冠状位,T1WI增强扫描,DWI及DEC-MRI。5、对小鼠移植瘤DWI及DCE-MRI原始图像进行后处理后获得ADC及K_transmap,使用热点法在肿瘤最大层面上分别选取五个ROIs,分别测量得到r ADC及K_trans值,计算平均值作为该移植瘤的r ADC及K_trans值。6、比较患者脑胶质瘤与相应小鼠原位移植瘤常规MRI,DWI-及DCE-MRI特征的差异。7、患者脑胶质瘤组织及相应小鼠移植瘤组织石蜡包埋后行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,H&E staining）和CD34免疫组织化学染色,通过组织病理染色探究患者脑胶质瘤与移植瘤磁共振特征差异的病理基础。8、患者脑胶质瘤组织（Patient tumor 1,2 and 3）及相应小鼠原位移植瘤组织（Xenograft 1,2 and 3）进行转录组测序,比较患者脑胶质瘤与原位移植瘤基因表达的差异。第三部分:抗血管治疗后脑胶质母细胞瘤血管新生方式变化的DCE-MRI评价1、建立U87 BALB/c小鼠原位胶质母细胞瘤模型。2、建模后21天,采用BEV（Bevacizumab,贝伐单抗）和TMZ（Temozolomide,替莫唑胺）单独及联合给药的方式对荷瘤鼠进行药物干预。BEV采用静脉注射的方式,剂量为15mg/kg,给药一次;TMZ采用口服给药的方式,剂量为50mg/kg/天,连续给药5天;TMZ和BEV联合干预时,首先静脉注射BEV,24小时后连续口服TMZ 5天,剂量为50mg/kg/天。对照组用0.9%生理盐水做相同处理。3、荷瘤鼠最后一次给药后1天、3天、6天进行MRI扫描,扫描序列包括T1WI横断位,T2WI冠状位,T1WI增强,DEC-MRI。4、对DCE-MRI原始图像进行后处理后获得K_transmap,采用热点法,在肿瘤最大层面选择伪彩图上信号较高的5个区域为ROIs,计算平均值得到该移植瘤的K_trans值。5、荷瘤鼠MRI扫描完成后,完整取出脑组织固定后行H&E染色、免疫组织化学染色（GFAP、CD34、TNC、CD34-PAS）及透射电镜检测。定量分析肿瘤区域微血管密度,血管共生、血管套叠、血管出芽及血管拟态数量。6、使用Spearman相关性分析计算K_trans与血管新生类型定量参数的相关性并计算相关系数。结果第一部分高级别脑胶质瘤生长早期血管新生相关基因的表达及PWI-MRI监测1、30例原发性高级别胶质瘤手术标本中9例成功建立NOD-SCID小鼠原位胶质瘤模型;能形成小鼠原位胶质瘤模型的病例其肿瘤组织具有更大的微血管密度（P=0.003）及更小的平均微血管管径（P=0.019）。微血管面积与肿瘤组织形成原位胶质瘤模型的能力没有明确关联（P>0.05）。2、具有形成原位移植瘤模型能力的病例其肿瘤组织血管新生相关基因BMPER（Bone morphogenetic protein endothelial cell precursor derived regulator）、CXCL10（Chemokine ligand-10）及HOXA9（Homeobox A9）表达明显高于不能成原位移植瘤模型的肿瘤组织（P=0.043,P=0.002,P=0.002）。3、2例原代肿瘤细胞体外分别抑制BMPER、CXCL10或HOXA9表达后肿瘤细胞成血管能力减弱（P<0.05,P<0.05,P<0.05;P<0.05,P=0.008,P<0.05）。4、小鼠原位移植瘤模型动态监测显示,在肿瘤生长第20天,BMPER呈高表达,CXCL10、HOXA9及肿瘤血管标志CD34呈低表达;在第30天,BMPER呈高表达,CXCL10及HOXA9呈低表达,但CD34表达增高;到第40天BMPER表达降低,CXCL10及HOXA9表达升高,而且与CD34的表达存在空间上的相关性;肿瘤晚期CXCL10、BMPER及HOXA9均呈低表达,CD34呈高表达。5、BMPER、CXCL10及HOXA9高表达的病例DSC-MRI扫描参数r CBV、r CBF以及DCE-MRI扫描参数K_trans、V_p明显高于低表达的病例（P=0.014,P=0.018,P=0.001,P=0.003）。ROC曲线分析显示,r CBV、r CBF、K_trans及V_p对上述基因是否高表达具有较好的鉴别能力,r CBV诊断阈值为1.481,曲线下面积为0.861,敏感性及特异性分别为100.00%、75.00%。r CBF诊断阈值为1.289,曲线下面积为0.847,敏感性及特异性分别为100.00%、75.00%。K_trans诊断阈值为0.209,曲线下面积为0.957,敏感性及特异性分别为100.00%、92.86%。V_p诊断阈值为0.139,曲线下面积为0.871,敏感性及特异性分别为80.00%、85.71%。第二部分:原代脑胶质瘤模型与相应患者脑胶质瘤MRI特征及基因表达差异研究1、移植瘤在小鼠颅内的生长方式分为两类,其中6例移植瘤呈弥散生长（xenografts1,2,3,4,5 and 6）,1例呈结节状生长（xenograft 7）。呈弥散生长的移植瘤与相应患者脑胶质瘤MRI特征的最大差异:移植瘤增强扫描后只有局部区域出现轻度强化,灌注扫描K_trans map显示肿瘤区域未见明显异常信号;移植瘤周围没有明显水肿信号,肿瘤内部信号均匀。呈结节状生长的移植瘤与相应患者脑胶质瘤MRI特征的最大差异:移植瘤与正常脑组织分界明显,移植瘤强化程度也明显低于相应患者脑胶质瘤7例移植瘤的K_trans值明显低于相应患者脑胶质瘤,且r ADC值高于相应患者脑胶质瘤（P=0.016,P=0.001）。2、6例呈弥散生长的原位移植瘤组织与患者脑胶质瘤组织CD34染色:移植瘤微血管面积及微血管管径明显低于相应患者脑胶质瘤（P=0.009,P=0.007）,而微血管密度在移植瘤与患者脑胶质瘤之间没有明显差别;结节状生长的移植瘤组织与患者脑胶质瘤H&E染色:移植瘤与正常脑组织边界较清楚而患者脑胶质瘤边界不清。3、原代原位移植瘤与相应患者脑胶质瘤之间存在明显的基因表达差异:Patient-1与Xenograft-1相比差异表达的基因共有3590个,Patient-2与Xenograft-2相比差异表达的基因共有5408个,Patient-3与Xenograft-3相比差异表达的基因共有3590个;对差异表达的基因进行聚类分析（GO analysis）显示,与原位移植瘤相比,患者脑胶质瘤血管生成相关基因（Angiogenesis and vasculature development related genes）,肿瘤细胞特性及细胞外基质相关基因（cell activation,cell adhesion,cell migration,cell motility and extracellular matrix related genes）,以及免疫相关基因（immune response,immune system process and immune effector process related genes）表达较高。而细胞周期及核分裂相关基因表达下降。第三部分:抗血管治疗后脑胶质母细胞瘤血管新生方式变化的DCE-MRI评价1、U87原位移植瘤内共鉴定出四种类型的血管新生,即血管共生、血管出芽、血管套叠及血管拟态。2、BEV干预组:给药后3天实验组血管出芽及血管套叠数量显著减少（P<0.05,P=0.002）。到给药后6天实验组微血管密度、血管套叠、血管共生及血管出芽数量数量明显减少（P<0.05,P=0.001,P<0.05,P<0.05）,但是与对照组相比实验组血管拟态数量反而增高（P<0.05）。3、TMZ干预组:最后一次给药后3天实验组微血管密度、血管共生、血管出芽及血管套叠数量明显减少（P<0.05,P=0.001,P=0.001,P<0.05）。给药后6天实验组与对照组相比微血管密度反而增高（P=0.003）,但血管共生数量、血管出芽数量、血管套叠数量及血管拟态数量在实验组与对照组之间均无明显差异。血管套叠是对TMZ最敏感的新血管生成方式,在TMZ干预1天后即明显减少（P=0.001）。4、BEV和TMZ联合干预组:实验组肿瘤区域微血管密度、血管共生、血管出芽及血管套叠数量在最后一次给药后1天（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P=0.01）及3天（P=0.003,P<0.05,P<0.05,P=0.025）都显著减少,血管拟态数量在两组之间没有明显差别。最后一次给药后6天,药物对肿瘤微血管的影响开始减弱,实验组与对照组相比只有血管出芽数量减少（P<0.05）,而微血管密度、血管套叠、血管共生及血管拟态数量均无明显差异。5、药物干预后U87原位移植瘤DCE-MRI特征变化:BEV单独干预组,从给药后1天到6天移植瘤K_trans值均明显低于对照组（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。TMZ单独干预组,最后一次给药后1天实验组与对照组之间移植瘤K_trans值没有明显差异,给药后3天移植瘤K_trans值显著降低（P<0.05）,但是给药后6天K_trans值反而高于对照组（P=0.007）。BEV和TMZ联合干预组,移植瘤K_trans值的变化与BEV单独干预组类似,最后一次给药后1天、3天及6天实验组移植瘤K_trans值均低于对照组(（P=0.022,P<0.05,P<0.05）。6、Spearman相关性分析显示,药物干预后血管出芽数量与移植瘤K_trans值有较好的相关性,BEV和TMZ单独或联合干预后,随时间的变化血管出芽数量与K_trans值呈显著正相关,r的值分别为0.9068、0.9806、0.8641（P<0.05）。结论:1、原发性高级别胶质瘤中,BMPER、CXCL10以及HOXA9通过促进肿瘤血管新生而促进肿瘤早期生长与进展,有可能成为抗血管治疗的新靶点;DSC-MRI及DCE-MRI扫描参数r CBV、r CBF、V_p及K_trans可以作为影像标志物无创预测肿瘤组织BMPER、CXCL10及HOXA9的表达程度。2、原代小鼠原位移植瘤模型并不能复制相应患者脑胶质瘤的MRI特征,而基因的差异表达可能是造成移植瘤与相应患者脑胶质瘤MRI特征差异的重要原因,因此移植瘤来源的MRI标志在临床应用时需要谨慎使用。3、BEV干预后胶质母细胞瘤肿瘤区域血管拟态数量的增多,以及TMZ治疗后微血管密度反弹性的增高,可能是胶质母细胞瘤抗血管治疗失败的重要原因;BEV和TMZ单独或联合干预后,血管出芽数量的变化与K_trans值呈正相关,K_trans值可以作为监测药物干预后血管出芽变化的潜在有效影像学指标。