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研究背景由于国民生活水平不断提高以及生活方式发生改变,在我国,糖尿病已成为继肿瘤、心血管病变之后的第三大威胁人类健康的慢性疾病。其中,皮肤损伤和伤口难愈问题是糖尿病进程中严重的并发症。成纤维细胞（fibroblast,FB）是皮肤组织的重要细胞成分之一,是真皮层中分泌细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的主要修复细胞,更是创伤愈合的关键与基础。从慢性糖尿病足溃疡分离的人真皮成纤维细胞相比于正常人真皮成纤维细胞显示出较低的增殖能力。因糖尿病伤口出现成纤维细胞表达水平下降、生长因子功能活性的降低等情况,导致糖尿病中真皮成纤维细胞生物学行为的改变,因此对于糖尿病患者来说,成纤维细胞的改变在创面愈合延迟甚至不愈合中起重要作用。抑瘤素（Oncostatin M,OSM）最初由Robbins等人于1986年从U937组织的淋巴母细胞培养上清中分离出来的,是一种对A375黑色素瘤细胞有生长抑制作用的因子,主要由激活的T细胞、单核细胞产生。抑瘤素是一种炎性细胞因子,属于白细胞介素-6类,IL-6因在免疫监视中起重要作用而被广泛用于肿瘤的基因-免疫治疗。OSM可抑制多种实体瘤的功能、增殖及转移,其中包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、肺癌等,也可抑制体外培养的造血祖细胞的分化等作用,OSM还可以通过诱导衰老抑制肝癌细胞增殖。OSM不但能够抑制部分肿瘤细胞的生长,还可以作用于其他多种细胞以及参与众多的生理病理过程,其可在多种疾病进程中发挥重要的作用,包括刺激造血、调节炎症反应、促进细胞去分化等功能。OSM能够促进心肌再生,诱导心肌细胞中SDF1和VEGF的生成,调节细胞外基质的降解。有文献汇报,抑瘤素还具有可促进成纤维细胞的生长及Kaposi内瘤细胞的增殖。胞外调节激酶ERK为MAPK家族的一员,ERK的信号传递途径涉及调节细胞生长和发育以及细胞分裂的信号网络核心。已有实验证实,OSM剌激肺部成纤维细胞受体后激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径,通过MAPK途径调节肺成纤维的活性,从而参与肺损伤修复。OSM能否通过激活ERK信号通路而促进高糖环境下人真皮成纤维细胞的增殖及细胞外基质的分泌及具体机制仍待研究。因此,本文主要就高糖环境下OSM促进人真皮成纤维细胞增殖和细胞外基质的分泌的主要机制进行探讨。第一部分建立人真皮成纤维细胞高糖模型目的探讨高浓度葡萄糖对人真皮成纤维细胞抑制的最适浓度和时间,建立高糖成纤维细胞模型。方法依据DMEM培养基中所含葡萄糖浓度不同将人真皮成纤维细胞分为5组:A:正常对照组:含25 mmol/L葡萄糖;B:高糖1组:含30 mmol/L葡萄糖;C:高糖2组:含35 mmol/L葡萄糖;D:高糖3组:含40 mmol/L葡萄糖;E:高糖4组:含45 mmol/L葡萄糖。1)MTT法检测高糖对人真皮成纤维细胞活力的影响。2)流式细胞术检测高糖对人真皮成纤维细胞周期的影响。3)免疫印迹试验（Western Blot,WB）检测ERK、p-ERK、CyclinD1蛋白的表达情况。结果1)MTT结果显示:真皮成纤维细胞的增殖活性随着葡萄糖浓度的增加而不断降低,呈浓度依赖性。结果显示,40mmol/L高糖培养48h相对正常对照组,差异有显著统计学差异（P<0.01）。2)流式细胞术结果显示:相对于正常对照组,40 mmol/L高糖处理组的细胞周期出现明显的G1期阻滞（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.01）。3)WB结果显示,细胞培养48h后,40 mmol/L高糖培养组较正常对照组ERK、p-ERK和CyclinD1蛋白表达明显减弱（P<0.01;P<0.01;P<0.01）;40 mmol/L高糖组细胞培养48h较40 mmol/L高糖组细胞培养36h,ERK、p-ERK和CyclinD1蛋白表达明显减弱（P<0.01;P<0.01;P<0.01）。结论高糖具有抑制人真皮成纤维细胞增殖活力的作用,当其浓度为40mmol/L,培养时间为48h时,可致人真皮成纤维细胞出现明显增殖抑制;40 mmol/L葡萄糖较正常对照组出现明显G1期阻滞,S期细胞显著减少,影响成纤维细胞的有丝分裂;并且高糖明显抑制人真皮成纤维细胞ERK、p-ERK、CyclinD1蛋白的表达。第二部分抑瘤素促进高糖环境下人真皮成纤维细胞增殖的作用目的探讨抑瘤素对高糖环境下人真皮成纤维细胞增殖的作用。方法1)使用不同浓度OSM作用于40 mmol/L葡萄糖培养的人真皮成纤维细胞高糖模型,将人真皮成纤维细胞分为:A:高糖组（40 mmol/L葡萄糖）,B:OSM1组（4ommol/L葡萄糖+25ng/ml OSM）,C:OSM2组（40mmol/L葡萄糖+50ng/ml OSM）,D:OSM3组（40mmol/L葡萄糖+100ng/ml OSM）,E:OSM4组（40mmol/L葡萄糖+200ng/ml OSM）。人真皮成纤维细胞培养完成后,用MTT法检测人真皮成纤维细胞活力。为探究抑瘤素促进人真皮成纤维细胞增殖的机制,进一步将细胞进行分组:A:对照组（25mmol/L葡萄糖）;B:高糖组（40mmol/L葡萄糖）;C:高糖+OSM组（40mmol/L葡萄糖+100ng/ml OSM）;D:高糖+OSM+PD98059（40mmol/L葡萄糖+100ng/ml OSM+PD98059）。2)流式细胞术检测抑瘤素对高糖环境中人真皮成纤维细胞周期的影响。3)WB检测细胞周期调控蛋白ERK、p-ERK、CyclinD1的表达。4)实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测ERK、CyclinD1的m RNA表达。结果1)MTT结果显示:OSM可以显著促进高糖模型人真皮成纤维细胞的增殖活力,100ng/ml OSM处理组细胞活性增高显著（P<0.01）,200ng/ml OSM处理组较100ng/ml OSM处理组细胞活性开始降低（P<0.01）;100ng/ml OSM处理组处理48h后较处理24h、36h细胞活性增高显著（P<0.01;P<0.05）。2)流式细胞术显示:与正常对照组相比,高糖组的S期细胞数减少（P<0.05）、G1期细胞数增多（P<0.05）;与高糖组相比,高糖+抑瘤素组的S期细胞数显著增加（P<0.05）、G1期细胞数减少（P<0.05）;与高糖组相比,高糖+抑瘤素+PD98059组的S期、G1期细胞数差异无统计学意义。3)Western blot结果显示,高糖组较正常对照组ERK、p-ERK和CyclinD1蛋白表达明显降低（P<0.01;P<0.01;P<0.01）;高糖+OSM组与高糖组相比ERK、p-ERK和CyclinD1蛋白表达明显增高（P<0.01;P<0.01;P<0.01）;高糖+抑瘤素+PD98059组与高糖组相比蛋白表达差异无统计学意义。4)PCR结果与Western blot检测结果一致,差异均具有统计学意义（P<0.01）。结论实验结果表明,100ng/ml OSM处理被高糖抑制生长的人真皮成纤维细胞48h,对细胞的增殖促进作用最显著。OSM促进高糖成纤维细胞G1期向S期的转化,从而促进有丝分裂,并可能通过ERK信号通路。OSM可以从基因和蛋白层面促进人真皮成纤维细胞CyclinD1的表达,并且这种作用可能是通过ERK通路实现。第三部分抑瘤素促进高糖环境下人真皮成纤维细胞细胞外基质分泌的作用目的探讨抑瘤素对高糖环境下人真皮成纤维细胞细胞外基质分泌的影响。方法1)首先将细胞分为:A:正常对照组（25mmol/L葡萄糖）;B:高糖组（40 mmol/L葡萄糖）;C:OSM1组（40mmol/L葡萄糖+25ng/ml OSM）;D:OSM2组（40mmol/L葡萄糖+50ng/ml OSM）;E:OSM3组（40mmol/L葡萄糖+100ng/ml OSM）;F:OSM4组（40mmol/L葡萄糖+200ng/ml OSM）,各组细胞培养48h。通过Western-Blot检测各组细胞内Collagen Ⅰ、Ⅲ及Fibronectin的蛋白表达水平。然后将细胞分组为:A:正常对照组（25mmol/L葡萄糖）;B:高糖组（40mmol/L葡萄糖）;C:高糖+OSM组（40mmol/L葡萄糖+100ng/ml OSM）;D:高糖+OSM+PD98059（40mmol/L葡萄糖+100ng/ml OSM+PD98059）。2)免疫印迹试验（Western Blot,WB）和实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测各组细胞内Collagen Ⅰ、Ⅲ及Fibronectin的相对表达量。结果1)100ng/ml OSM处理组较高糖培养组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、fibronectin蛋白的相对表达显著增强（P<0.01;P<0.01;P<0.01）200ng/ml OSM处理组较100ng/ml OSM处理组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、fibronectin蛋白的相对表达下降显著（P<0.01;P<0.01;P<0.01）。2)Western blot及PCR检测各组细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及Fibronectin蛋白和m RNA的表达情况,高糖组与正常对照组相比Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及Fibronectin蛋白表达明显降低（P<0.05;P<0.01;P<0.01）;高糖+OSM组与高糖组相比Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及Fibronectin蛋白表达明显增高（P<0.01;P<0.01;P<0.01）;高糖+抑瘤素+PD98059组与高糖组相比蛋白表达差异无统计学意义。PCR结果与WB结果基本一致,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论抑瘤素能够促进高糖环境下人真皮成纤维细胞Collagen Ⅰ、Ⅲ及Fibronectin的分泌,并可能是通过ERK信号通路。