以中华根瘤菌NP1 (Sinorhizobium sp.NP1)为原始菌株,通过同源克隆与Tail-PCR的方法,获得氨单加氧酶基因(amo)的全基因序列与亚硝酸盐还原酶基因(nir)的全基因序列。amo基因全长1089 bp,编码362个氨基酸, AMO存在信号肽,蛋白的成熟位点在第37-38的VLA-SF之间,有九个跨膜区段;nir基因全长1137 bp,编码378个氨基酸,NIR与裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)NIR的二级结构和三级结构相似,NIR中存在信号肽,蛋白的成熟位点在第33-34的AHA-AG之间,该蛋白前50个氨基酸内有一个跨膜螺旋信号。以自杀穿梭质粒pJQ200SK为原始载体,构建NP1 amo基因敲除质粒pJQ200SK-amo-Tc。采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得amo基因敲除菌株NP1::amo。通过本贝洛氏(Berthelot)法对氨氮进行测定,发现NP1::amo的脱氮效率比原始菌株NP1下降约35%,该结果表明本实验中所克隆的氨单加氧酶基因为脱氮关键酶基因。采用组成型启动子D型乳酸脱氢酶启动子(dld)加强amo基因的表达,以克隆载体pBBR1MCS-5为原始载体,构建NP1 amo基因增强表达的质粒载体p5:dld-amo。采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得重组菌株NP1::dld-amo。通过本贝洛氏(Berthelot)法对氨氮进行测定,NP1::dld-amo的脱氮效率比NP1提高了10%左右。质粒稳定性检测显示质粒能够在NP1中稳定存在12代以上。克隆gfp绿色荧光蛋白基因与dld-amo融合表达,以克隆载体pBBR1MCS-5为原始载体,构建完成克隆质粒p5:dld-amo-gfp并将其转入到大肠杆菌中对amo基因表达进行定位,荧光显微镜下观察到微弱的绿色荧光,可以初步推测氨单加氧酶为膜内蛋白。