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目的:
腹泻是一种常见病,具有很高的发病率,针对造成腹泻的诸多因素,用复方中药治疗腹泻这一课题已经占领了国内国外腹泻研究的重要地位。本实验通过对SD大鼠造腹泻模型,之后给予相应剂量复方双苓止泻散及阳性药物治疗,从而观察其小肠粘膜上皮细胞的病理变化;应用多种组织胚胎学技术方法手段来观察和检测复方双苓止泻散对腹泻的治疗效果,近而探讨其合理配方。
方法:
健康成年SD大鼠,随机分组,造腹泻模型。造模成功后将腹泻模型组随机分为5组并给予相应的处理。待将所有组取材后,把组织分别固定在4%多聚甲醛、4%戊二醛、70%酒精中,用HE染色、免疫组化、透射电镜及流式细胞术等手段进行形态学检测。
1.实验动物:健康成年雌、雄SD大鼠(200g±20g),由河北医科大学实验动物中心提供。
2.腹泻模型的制备:
取已在实验室饲养2天的SD大鼠,随机分为对照组10只及腹泻模型组50只,每天分别用自来水和浓缩为0.3g/ml的番泻叶煎剂灌胃,均为15ml/kg次,一天两次。造型前10小时禁食,自由饮水。大鼠单只单笼饲养,鼠笼底垫有滤纸及铁丝网,连续造型6天并收集粪便,用腹泻指数来确定腹泻模型的成功建立。(Fig.25) 3 中药治疗组灌胃:
于腹泻模型制备成功后,将模型组随机分为腹泻组及4个治疗组,腹泻组灌以生理盐水,治疗组用药剂量分别为小剂量治疗组:0.31g/kg复方双苓止泻散;中剂量治疗组:0.62g/kg复方双苓止泻散;大剂量治疗组:1.24g/kg复方双苓止泻散;阳性对照组:0.62g/kg万鑫母仔快康,生产批号:050601。每天灌胃一次,每次1ml。
4 动物取材:
用药48小时后,将所有组取材。将大鼠用10%水和氯醛腹腔注射麻醉,注射量为0.4ml/1 00g体重,麻醉后仰卧固定于鼠台,无菌条件下活体取材。取材部位为距离Treitz韧带3~5cm处小肠组织,取材后将组织分别固定,以备检测。
5 观测指标:
5.1腹泻指数,确定腹泻模型的成功建立与否。
5.2复方双苓止泻散及阳性对照药物治疗前后大鼠的生命体征。
5.3常规HE染色,观察小肠粘膜上皮的组织结构变化。
5.4石蜡切片光镜观察,做L-selectin免疫组化染色。
5.5流式细胞术做小肠组织细胞增殖与调亡的图象分析。
5.6透射电镜观察小肠粘膜上皮细胞超微结构,看有无炎性病变及病变恢复后的细胞器变化。
5.7全自动显微照相机照相并用麦克奥迪6.0图象分析系统分析可吸收光密度值。
6 数据统计:用SPSS-13软件做数据统计学处理结果1 免疫组化结果显示:标记中性粒细胞膜上L-selectin抗体的棕黄色区域于治疗后减少。正常对照组、阳性对照组、腹泻组、小剂量治疗组、中/大剂量治疗组之间均有显著差别(P<0.01),中剂量治疗组与大剂量治疗组之间有差别,但差别不大。 (0.01<P<0.05)。 (Fig.26)2 透射电镜结果显示:残缺不全的小肠粘膜上皮细胞中细胞器超微结构治疗后的变化趋于正常小肠粘膜组织。
3.流式细胞学结果显示:对小肠粘膜上皮细胞PI值(增殖指数)及%Gated(凋亡率)做组间比较,正常对照组、阳性对照组、腹泻组、小剂量治疗组、中/大剂量治疗组之间均有差别(P<0.05),中剂量组与大剂量治疗组间无明显差别(P>0.05)。
结论:
1.复方双苓止泻散促进小肠粘膜组织形态恢复。
2.复方双苓止泻散对腹泻的治疗有效,治疗后,腹泻的炎性病变减轻。
3.中、大剂量复方双苓止泻散与阳性对照药物的作用效果优于小剂量复方双苓止泻散;且中、大剂量复方双苓止泻散优于阳性对照药物。