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microRNA (miRNA)是一类非编码小RNA,广泛存在于真核生物细胞内,在精细调控基因表达及生物生长发育过程方面发挥着重要作用。最近的一些研究表明miRNA在多个方面参与了免疫调控反应,然而,目前关于miRNA介导的先天免疫调控作用机制仍然不十分清晰,需要进一步的深入研究。果蝇是重要的模式生物,在生物学研究中有着极其重要的作用。对果蝇免疫相关miRNA的识别、验证及其调控关系的研究,不仅对揭示果蝇自身免疫系统发育和响应机制有着重要的意义,而且也有助于理解脊椎动物中miRNA的起源、进化和调控方式。目前在果蝇中已经报道的与免疫作用相关的miRNA仅仅有miR-8、miR-let-7和miR-125。因此,为了识别更多的果蝇免疫相关的miRNA,在本论文中,首先构建了UAS-GAL4高表达miRNA果蝇体系,进一步用miR-8和miR-let-7验证已构建的UAS-GAL4高表达miRNA系统的可靠性,在此基础上,利用已构建好的UAS-GAL4高表达miRNA体系对果蝇免疫相关miRNA进行筛选和验证。本论文研究获得了以下主要结果：(1)首先利用基因型为da-Gal4和ppl-Gal4的果蝇分别与不同miRNA的果蝇突变株进行杂交,收集高表达miRNA的子代(da-Gal4/UAS-miRNA),发现该基因的果蝇没有子代,均在胚胎期致死,这个结果表明利用da-Gal4驱动基因在果蝇全身的高表达会导致果蝇致死。然而,我们也能收集到极其少数的高表达miRNA的子代(ppl-Gal4/UAS-miRNA),并通过荧光定量PCR分析发现,高表达miRNA的子代(ppl-Gal4/UAS-miRNA)果蝇体内的miRNA比对照组有显著的上调,说明ppl-Gal4可以驱动基因在果蝇脂肪体内高表达,但是收集效率比较低。(2)为了构建稳定的表达系统,进一步构建了Gal4-Gal80ts驱动系统,我们将不同UAS-miRNA基因型的果蝇与Gal4-Gal80ts基因型的果蝇进行杂交。首先在18℃的环境中培养,待子代有成虫羽化,立即收集相应的基因型的子代移到29℃的环境中培养,激活Gal4蛋白的表达,进而驱动miRNA的表达,发现果蝇能在特定的时期激活miRNA的表达。本论文利用该Tub-Gal80ts; UAS-miRNA/Tub-Gal4系统实现了果蝇miRNA高表达且效果显著。(3)利用miR-8和miR-let-7,对上述构建的Tub-Gal80ts; UAS-miRNA/Tub-Gal4系统进行验证。在高表达miRNA果蝇株Tub-Gal80ts; UAS-miR-8/Tub-Gal4和Tub-Gal80ts; UAS-miR-let-7/Tub-Gal4体内,miRNA的表达与对照组相比有显著上调,同时对高表达miR-8和miR-let-7的果蝇株的Toll和Imd信号通路进行了研究,发现Tub-Gal80ts; UAS-miR-8/Tub-Gal4高表达株体内的Drosomycin表达量与对照组相比显著下调,也即miR-8通过调节果蝇的Toll信号通路Drosomycin的表达从而调节果蝇的免疫,这与已有的研究结果一致；这个结果同时也证明了我们构建的Tub-Gal80ts; UAS-miRNA/Tub-Gal4系统的可靠性。此外,在果蝇S2细胞中证实了miR-let-7也会影响果蝇Imd通路Diptericin的表达。然而我们也发现,在果蝇体内miR-let-7不会抑制果蝇Diptericin的表达。(4)利用生物信息学技术对果蝇可能与免疫有关的miRNA进行了分析,在此基础上,利用Tub-Gal80ts; UAS-miRNA/Tub-Gal4系统分别高表达了miR-34、miR-375和miR-958,并通过荧光定量PCR检测了高表达果蝇体内的miRNA和Drosomycin及Diptericin的表达量。结果表明miR-34、miR-375和miR-958的表达均显著上调,而仅有Tub-Gal80ts;UAS-miR-958/Tub-Gal4果蝇株体内的Drosomycin的表达量下调,说明miR-958与果蝇的Toll免疫信号通路有关,调控着果蝇的免疫。本论文不仅初步验证了miR-958的免疫功能,而且同时也进一步验证了Tub-Gal80ts; UAS-miRNA/Tub-Gal4系统的可行性。本论文结果为利用Tub-Gal80ts; UAS-miRNA/Tub-Gal4系统在果蝇体内高表达miRNA提供了帮助,并为更深入的研究果蝇miRNA的免疫功能提供了重要的基础。