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聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate, PHAs）是细菌在碳源充足、氮源缺乏的情况下产生的作为胞内碳源和能源储存物的生物聚酯，其具有良好的生物相容性、生物可降解性、光学活性、压电性、气体相隔性等独特性质，在医药、组织工程、化妆品、农业、工业上具有广泛应用，是当今生物材料领域最有前景最为活跃的研究热点之一。然而，目前PHA的生物合成由于产率低、成本高、单体组分单一等问题，还不能满足各领域对于新型生物材料的需求，严重制约着PHA的广泛应用。目前PHA生产主要依赖于微生物发酵，在微生物发酵合成PHA的所有发酵条件因素中，底物是一个重要因素，其成本占到总成本的28-50%。采用廉价底物将在很大程度上降低PHA的生产成本。粗甘油是生物柴油在生产过程中产生的主要副产物（甘油），利用甘油合成PHA既可以解决甘油过度积累带来的废水、废气等环境污染的问题，又可以降低PHA的生产成本。但是当以粗甘油为底物合成PHA时，由于生物柴油副产物中甘油的高渗透压，PHA的积累比例会严重下降。如何解决甘油高渗透压问题成为利用生物柴油副产物合成PHA的关键。烯醇酶（Enolase）是一个抗逆性基因，是糖酵解途径中的关键酶，能催化2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸。带有烯醇酶基因的假单胞菌能更好的在甘油高渗透压逆性环境中生存。本研究针对假单胞菌利用粗甘油生产PHA出现的低产率问题，做了两方面工作：一是对实验室保存的可合成PHA的三株假单胞菌进行甘油耐受力评估，筛选出甘油耐受力比较好的菌株；二是利用基因工程技术克隆抗逆性基因——烯醇酶基因，构建重组菌，以提高菌株耐受甘油能力。针对PHA产生过程中成分单一的问题，利用SOE PCR技术以富氧产碱菌（R. eutropha）PHA合酶基因（PhaCRe）和嗜水气单胞菌WQ（A. hydrophila WQ）PHA合酶基因（PhaCAh）为亲本，构建嵌合酶，以产生新型的PHA。研究结果如下：（1）三株假单胞菌的甘油耐受力评估。对实验室筛选得到的三株假单胞菌（P.oleovorans ZJ03, P.oleovorans ZJ166, P. corrugata CY06）在含有不同浓度梯度甘油矿物盐培养基中进行发酵，并通过气相色谱法（GC）分析确认其PHA产率，对各菌株利用甘油生产PHA的能力及甘油耐受度进行评估，结果表明，P.oleovorans ZJ03的甘油耐受性比较好。（2）烯醇酶基因克隆及酶活力测定。利用PCR技术从P. putida KT2442基因组DNA中扩增烯醇酶基因，构建pET28a-Eno表达质粒，转化进入大肠杆菌BL21（DE3），筛选转化子，经测序及序列比对，证明克隆的基因为烯醇酶基因（序列号为JQ864251）。将重组菌接种于LB培养基培养，当OD达到0.6时，用1mM IPTG诱导4小时，离心收集菌体细胞。超声波破碎菌体，上清液经Ni-NTA亲和层析柱纯化，获得蛋白Enolase，分子量大小为46kD。获得的烯醇酶蛋白酶活力经分光光度计直接测得酶活力为510.9U/L。（3）构建产新型PHA嵌合酶。PHA成分单一极大地限制了PHA的广泛应用。嵌合体构建是创造新酶的一种方法。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶，它的活性和底物特异性决定着PHA的含量和组成。对PHA合酶进行基因工程改造可以改变PHA合酶的底物特异性、提高催化活性、改变单体组成、获得新型PHA。本研究为获得具有双亲酶活性的酶，从富氧产碱菌（R. eutropha）PHA合酶基因（PhaCRe）和嗜水气单胞菌WQ（A. hydrophila WQ）PHA合酶基因（PhaCAh）出发，用数据库对PhaCRe和PhaCAh的二级结构进行预测，找到两个酶的合适的结合位点，利用这个结合位点，构建嵌合酶基因PhaCAhRe。将嵌合基因连接到组成型表达载体pBBR1MCS2上构建重组质粒，将重组质粒pBBR1MCS2-PhaCAhRe结合转化入R. eutropha PHB-4中。利用加入不同碳源的矿物盐培养基，30℃，200rpm条件下摇瓶发酵重组菌，72h后收集菌体称重并做GC验证嵌合PHA合酶活性。结果表明，嵌合菌株AHRE在以葡萄糖酸钠和果糖为碳源时，只产PHB。在以辛酸钠、月桂酸、油酸、辛酸钠和葡萄糖酸钠混合物为碳源时，与亲本相比，除了产生3HB和3HHx，还产生了新的组分3HO。当以辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源发酵时，PHA含量最高，为57.54%。当以辛酸钠为单一碳源时，3HO单体组成含量最高，占PHA总量的1.932%。表明嵌合酶构建成功，获得了新型PHA。综上所述，本研究筛选出具有甘油耐受力比较好的菌株，构建的抗逆性基因烯醇酶基因经诱导表达后具有酶活。这对提高菌株对高甘油浓度的耐受力，利用价格低廉的生物柴油副产物甘油合成PHA，解决生物柴油副产物过度积累带来的环境问题，降低PHA的生产成本具有重要意义。同时，构建的嵌合酶PhaCAhRe能利用合适碳源产生新型PHA。这对今后利用基因工程技术构建产新型PHA的嵌合酶提供了理论基础，对改变PHA的单体组成提供了方法，将极大的促进PHA的更为广泛的应用。