论文部分内容阅读
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)最常见的微血管并发症之一,发病机制与糖代谢失衡、氧化应激、炎症等多种因素有关,但尚未完全清楚。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成,足细胞受损可导致蛋白尿,在DN的发病中发挥重要作用,因此许多学者认为DN属于“足细胞病”。微小RNA(Micro RNA,miRNA)是一类内源性非编码的单链小分子RNA,广泛参与真核细胞生物体的发育、细胞分化、增殖、凋亡及免疫反应等。近年有研究发现,miRNA异常表达参与了DN的发生发展。其中的miR-346是新近发现的参与众多疾病的miRNA,不但在炎症反应中发挥重要作用,DN时miR-346的表达亦发生了异常变化。丝胶是蚕丝中包被在丝素外围的高分子水溶性蛋白,主要由18种氨基酸组成,分子量为10-300kd,具有生物相容性,可生物降解。本课题组前期根据《本草纲目》的记载,结合民间蚕茧开水浸泡用以控制血糖的验方,研究发现,丝胶能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖、调节血脂代谢紊乱、保护糖尿病时肾脏损伤,但丝胶保护肾脏的作用机制尚不清楚。本研究首先建立高糖致损伤小鼠足细胞模型,并给予丝胶干预,观察丝胶对高糖刺激下足细胞miR-346、炎症因子IL-6表达的变化,并应用miR-346 inhibitor转染足细胞,综合分析丝胶是否通过调控miR-346对高糖刺激下足细胞损伤具有保护作用,为DN的防治提供新思路。第一部分:丝胶对高糖刺激下足细胞Nephrin、IL-6、miR-346表达的影响目的:建立高糖致损伤足细胞模型,给予不同剂量的丝胶进行干预,通过检测各组细胞足细胞表面标记蛋白Nephrin蛋白、miR-346以及IL-6表达的变化情况,探讨丝胶是否对高糖致损伤足细胞具有保护作用,以及确定丝胶保护作用的最佳剂量。方法:1条件永生化小鼠足细胞在33℃、5%二氧化碳培养箱中培养,贴壁增殖;而后转入37℃、5%二氧化碳培养箱培养,取对数生长期足细胞用于后续实验。以浓度为30mmol/L的葡萄糖培养48h作为高糖对照组(HG组),并设置正常对照组(NG组:5.5mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(MG组:5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇),以及丝胶干预组(LS组:30mmol/L葡萄糖+150μg/ml丝胶、MS组:30mmol/L葡萄糖+300μg/ml丝胶、HS组:30mmol/L葡萄糖+600μg/ml丝胶)。各组足细胞同步化处理12h,不同药物作用48h。2倒置显微镜下分别观察33℃培养、37℃培养时足细胞的形态结构,以及观察各组足细胞的形态结构。3应用Western blot法检测足细胞表面标记蛋白Nephrin的表达。4应用实时荧光定量PCR技术检测足细胞miR-346的表达。5应用酶联免疫吸附试验检测足细胞IL-6蛋白的表达,实时荧光定量PCR技术检测足细胞IL-6 m RNA的表达。结果:1足细胞的形态结构1.1不同培养温度下足细胞的形态结构:在33℃条件下培养的足细胞处于增殖状态,镜下观察细胞体积小,增长快,细胞间隙小,未出现足突结构,细胞呈“铺路石”状。在37℃条件下培养的足细胞处于分化状态,镜下观察细胞体积较33℃培养时变大,出现足突结构,相邻的足细胞之间足突相互连接,呈树枝状分布。1.2各组足细胞的形态结构:NG组足细胞的形态结构与37℃条件下培养的足细胞相同;MG组足细胞的形态结构与NG组相比无明显差别;HG组细胞皱缩变圆,足突减少融合甚至消失,细胞间隙变大,甚至脱落死亡;LS组、MS组、HS组三组足细胞的形态结构与HG组相比,细胞体积变大,足突较明显,细胞间隙小,更接近NG组细胞的形态。2 Nephrin在各组足细胞中的表达:结果显示,MG组与NG组相比,Nephrin蛋白的表达量无明显差别(P>0.05);HG组Nephrin蛋白的表达量较NG组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,LS组、MS组、HS组三组足细胞Nephrin蛋白的表达量均明显升高,其中HS组最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3 miR-346在各组足细胞中的表达:结果显示,NG组、HG组以及MG组三组足细胞miR-346的表达无明显差异(P>0.05);LS组、MS组、HS组三组足细胞miR-346的表达较NG组、HG组以及MG组明显升高,其中HS组miR-346的表达水平最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4 IL-6在各组足细胞中的表达:结果显示,MG组与NG组相比,IL-6蛋白的表达量无明显差别(P>0.05);与NG组相比,HG组IL-6的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,LS组、MS组、HS组三组足细胞IL-6的表达量均明显降低,其中,HS组最低,差异具有统计学意义(P<0.05)。各组足细胞IL-6 m RNA表达的变化趋势同IL-6蛋白。第二部分:丝胶是否通过调控miR-346保护高糖刺激下足细胞损伤目的:应用miR-346的抑制剂(inhibitor)转染足细胞,并给予600μg/ml的丝胶干预,综合分析丝胶是否通过调控miR-346对高糖刺激下足细胞具有保护作用。方法:1足细胞分组包括:正常糖组(NG组:5.5mmol/L葡萄糖)、高糖对照组(HG组:30mmol/L葡萄糖)、丝胶干预组(SI组:30mmol/L葡萄糖+600μg/ml丝胶)、丝胶+miR-346 inhibitor组(miR-346 inhibitor组:30mmol/L葡萄糖+600μg/ml丝胶+Micr OFF mmu-miR-346-5p inhibitor)以及丝胶+miR-346 control组(miR-346 control组:30mmol/L葡萄糖+600μg/ml丝胶+Micr OFF mmu-miR-346-5p control)。2应用酶联免疫吸附试验检测足细胞IL-6蛋白的表达,实时荧光定量PCR技术检测足细胞IL-6 m RNA的表达。结果:1各组足细胞IL-6的表达结果显示,NG组、SI组、miR-346 control组三组足细胞IL-6蛋白的表达量无明显差异(P>0.05);HG组与miR-346 inhibitor组两组足细胞IL-6蛋白的表达量无明显差异(P>0.05)。与NG组相比,HG组、miR-346 inhibitor组足细胞IL-6蛋白的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组、miR-346 inhibitor组相比,SI组、miR-346 control组足细胞IL-6蛋白的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。各组足细胞IL-6 m RNA表达的变化趋势同IL-6蛋白。结论:1高糖环境可致足细胞损伤,且与炎症反应有关。2丝胶对高糖致损伤足细胞具有保护作用,其中600μg/ml的丝胶效果最佳,机制可能与丝胶提高miR-346的表达水平抑制炎症反应有关。3丝胶可通过提高miR-346的表达水平减轻炎症反应,从而保护高糖致足细胞损伤。