成体干细胞、胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)在研究发育生物学、疾病发病机制、细胞治疗、药物筛选等领域具有广阔的应用前景,而如何诱导其定向分化,鉴定和分选特定的功能细胞是急待解决的关键科学问题。本研究基于多重组位点的载体构建技术,首先构建模块的细胞或组织特异性启动子控制的报告基因或功能基因系统,并将报告基因载体导入神经干细胞(NSCs)、人ES细胞,分别向相应的细胞类型诱导分化,观察报告基因系统指示不同分化阶段的稳定性和特异性,在此基础上鉴定分化细胞的功能;进而利用aP2和2.3Col组织特异启动子控制的报告基因载体导人MSC并诱导向成骨和成脂分化,通过检测报告基因表达的变化,进行成骨成脂相关药物筛选的初步研究;最后将携带功能基因的载体导入小鼠ES细胞并检测相关基因的表达及其功能。本研究不仅有助于我们获得高效的干细胞定向诱导分化方案,深入理解的其体内外分化特性,为研究干细胞的增殖分化机理奠定良好的基础;同时也为进一步利用研究人类疾病的发病机制,以及药物筛选提供可靠的依据。本研究主要分为以下四个部分：第一部分：含多重组位点的模块载体系统的建立。第二部分：报告基因载体在人ES细胞分化研究中的应用。第三部分：报告基因载体在药物筛选中的应用。第四部分：功能基因载体在干细胞安全性研究中的应用。　　 第一部分：含多重组位点的模块载体系统的建立。　　 目的：利用多重组位点的Gateway技术快速、高效的构建模块的慢病毒载体系统(包括三载体和四载体系统)。　　 方法：⑴通过BP重组反应,将携带att位点的启动子、目的基因和IRES-eGFP序列分别与pDoNR P4Ph、pDONR221他pDONR P2rP3连接,得到pUp-promoter,pDown-gene和pTail-IRES/eGFP。⑵通过酶切、连接反应将pLenti6/BLOCK-iT-DEST中的attR1和attR2位点替换为attR4和attR2,同时将SV40启动子序列替换为PGK启动子,其下游的抗性基因可包括neomycin,hygromycin,puromycin,blasticidin等,得到不同的目的载体pDest。⑶通过LR重组反应,将携带启动子的入门克隆pUp-promoter,携带目的基因的入门克隆pDown-gene(和pTail-IRES/eGFP),与目的载体pDest-puromycin进行连接,构建pLVpuro/promotergene(pLVpuro/promoter-gene-IRES/eGFP)的表达载体。　　 结果：①通过BP重组反应得到系列的入门载体,包括pUp-promoter,pDown-gene以及pTail-IRES/eGFP。②通过酶切、连接反应得到携带不同抗性基因的目的载体,包括pDest-puro、pDest-neo、pDest-hygro或pDEST-neo等。③通过LR重组反应得到pLVpuro/promoter-gene(pLVpuro/promoter-gene-IRES/eGFP)的慢病毒表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌后,得到单细菌克隆。　　 结论：成功构建模块的pLVpuro/promoter-gene(pLVpuro/promoter-gene-IRES/eGFP)的慢病毒表达载体。　　 第二部分：报告基因载体在干细胞分化研究中的应用。　　 目的：取3个携带报告基因的pLVpuro/promoter-reporter gene的慢病毒载体转染相应的细胞系进行测试。取测试成功AFP-hrGFP载体进行病毒包装,导入人ES细胞中,然后加入诱导试剂促进ES细胞向肝细胞分化,以获得表达AFP的绿色荧光细胞,并进行相关的鉴定分析。　　 方法：⑴将各种携带报告基因的pLVpuro/promoter-reporter gene的慢病毒载体进行线性化,通过Fugene6转染进入相应的细胞系。⑵将AFP-hrGFP慢病毒载体导入人ES细胞。转导后用嘌呤霉素筛选纯化,挑选单克隆进行后续实验。⑶加入各种诱导试剂促进人ES细胞向肝细胞,以获得表达AFP的绿色荧光细胞,并进行免疫组化和染色等的相关功能分析。　　 结果：①携带报告基因的pLVpuro/promoter-reporter gene的慢病毒载体在相应的细胞系观察到绿色荧光蛋白的表达。②hES细胞转导5天后,加入1-5μg/ml的嘌呤霉素开始筛选,可以得到抗嘌呤霉素的携带外源质粒的纯化的hES细胞。③将干细胞诱导分化后,获得了表达AFP的绿色荧光细胞,通过相关鉴定分析来源于转导AFP的荧光细胞证实为肝细胞。　　 结论：⑴成功利用慢病毒转导hES细胞,并通过筛选获得纯化的细胞群。⑵成功将组织特异性启动子控制的报告基因载体系统应用于于细胞的诱导分化,为以后分化机理和移植治疗的研究提供了很好的工具。　　 第三部分：报告基因载体药物筛选中的应用。　　 目的：选取aP2-hrGFP或aP2-hrGFP与2.3Col-RFP同时转导人MSC细胞(hMSCs),然后诱导分化同时观察荧光的变化;在脂肪分化体系中加入Rapamycin观察荧光的变化;探讨利用报告基因载体进行成脂或成骨相关药物筛选的可能性。　　 方法：⑴将aP2-hrGFP或同时将aP2-hrGFP和2.3Col-RFP导入人MSC细胞。转导后进行筛选纯化。⑵诱导aP2-hrGFP hMSCs成脂分化,观察到荧光的变化,以及QPCR检测aP2基因的表达情况,同时用油红O染色。⑶在分化体系中加入Rapamycin,荧光镜下观察和酶标仪检测荧光表达的变化。⑷加入成骨和成脂诱导液aP2-hrGFP/2.3Col-RFP hMSCs向成骨和脂肪细胞分化,观察荧光的变化。　　 结果：①加入嘌呤霉素筛选,得到纯化的携带aP2-hrGFP hMSCs和aP2-hrGFP/2.3Col-RFP hMSCs。②诱导aP2-hrGFP hMSCs成脂分化,观察到随着分化时间的延长,荧光逐渐增强,其结果与QPCR检测aP2基因的表达情况和油红O染色的结果一致。③在脂肪分化体系中加入Rapamycin,发现绿色荧光的表达随着浓度的增加和时间的延长而逐渐减弱,酶标仪检测的结果与荧光观察的结果一致。④在aP2-hrGFP/2.3 Col-RFP hMSCs分化体系中,同时加入成脂和成骨诱导剂,可以观察到hrGFP和RFP的表达随着时间的延长而逐渐增强。　　 结论：aP2和2.3Col控制的报告基因可以很好的指示人MSC细胞的成骨或成脂分化过程,可以用于筛选成脂或成骨相关的药物。　　 第四部分：功能基因载体在干细胞安全性研究中的应用。　　 目的：选取携带功能基因deltaTK慢病毒载体EF1α-deltaTK转导小鼠ES细胞,检测deltaTK的表达及其体内外的基因功能。　　 方法：⑴将EF1α-deltaTK慢病毒载体导入小鼠ES细胞,并进行筛选纯化。⑵通过免疫荧光染色和体内外分化实验检测转导后小鼠ES细胞的干细胞特性。⑶在培养体系中或体内成瘤实验中加入GCV,观察和检测TK基因的功能。　　 结果：①成功获得纯化的转导后EF1α-deltaTK小鼠ES细胞。②鉴定结果表明,转导后的小鼠ES细胞表达ES的特异标记物Oct4和SSEA-1,具有在体内外向三胚层分化的能力。③体外试验结果表明,加入一定浓度的GCV可以导致EF1α-deltaTKmESCs的凋亡;体内试验的结果表明,注射GCV可以导致EF1α-deltaTK mESCs形成的畸胎瘤变小。　　 结论：功能基因表达载体可以帮助我们在干细胞中表达特定基因,为提高干细胞应用的安全性提供了很好的研究手段。