论文部分内容阅读
我国是世界上结肠癌发病率最高的国家之一,其死亡率位居所有恶性肿瘤死亡率的前五位。结肠癌患者的预后与肿瘤分期密切相关,但是很多患者诊断时已经处于晚期,失去了根治性手术的机会。其中位生存时间仍然较短且生活质量很差。结肠癌的发生发展是一个极为复杂的过程,其中肿瘤细胞无限增殖、细胞迁移运动、粘附、侵袭等能力以及肿瘤微环境的变化在肿瘤浸润与转移上具有非常重要的意义。因此探讨调控结肠癌增殖与细胞凋亡的相关基因及其产物在结肠癌发生过程中的作用,不仅有助于加深我们对结肠癌调控机制的理解和认识,也为结肠癌的早期诊断和治疗靶点的发现提供更多的实验基础和理论依据。胞质分裂1蛋白调节子（protein regulator of cytokinesis 1,PRC1）基因是有丝分裂期的关键蛋白分子,其作用于细胞胞质分裂期。已有多个研究认为PRC1能够促进胃癌、肺腺癌、肝癌、乳腺癌以及前列腺癌的细胞增殖能力,并可作为预后差的预测因子。然而,PRC1基因在结肠癌中的表达情况,以及与临床病理特征及预后的关系,以及对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响仍不清楚。本课题首次研究PRC1在结肠癌中的表达情况,并分析其与临床病理特征、生存预后之间的相关性;研究PRC1对结肠癌细胞增殖及凋亡等生物学功能的影响。以期为探索结肠癌的发病机制及治疗靶点提供新的理论基础。本课题通过以下三个方面开展研究:1、PRC1在结肠癌组织中的表达及与临床病理、预后相关性研究;2、PRC1对结肠癌细胞生长和增殖的作用,PRC1对结肠癌细胞凋亡的影响;3、动物实验研究PRC1调控结肠癌增殖的作用。材料与方法:1、在Oncomine（www.oncomine.org）公共数据库分析PRC1的mRNA表达情况及意义。利用qRT-PCR、Western blot及免疫组化（IHC）的方法在结肠癌及配对癌旁正常组织中检测PRC1的mRNA及蛋白的表达情况。利用90对结肠癌及癌旁的组织芯片,通过IHC方法检测PRC1的表达情况,并分析其与临床病理特征及预后关系。2、选择3株PRC1高表达的结肠癌细胞株（HCT116,SW480,HT-29）,通过慢病毒感染的方式敲降PRC1,并用qRT-PCR及Western blot验证其敲降效率,运用MTT实验和平板克隆形成实验检测细胞生长、增殖能力的变化。运用流式细胞仪检测PRC1敲降后细胞周期及凋亡的变化,并进一步运用Western blot方法检测周期相关及凋亡相关蛋白指标的改变。3、通过慢病毒感染稳定敲降PRC1的HCT116细胞株,分成两组（HCT116空质粒组和HCT116-shRNA-PRC1-1细胞组）,构建裸鼠皮下瘤模型,观察两组皮下瘤生长的速度、肿瘤体积、肿瘤重量及运用免疫组化的方法检测周期相关蛋白的表达情况等。实验结果:1、①在Oncomine（www.oncomine.org）公共数据库中,发现PRC1在多个结肠癌研究的芯片中呈现高表达,在结肠癌中PRC1的mRNA高表达是差预后因素。②运用qRT-PCR、Western blot及免疫组化（IHC）的方法发现其mRNA及蛋白表达在癌组织中明显上调。③利用90对结肠腺癌及癌旁的组织芯片,通过IHC方法检测PRC1表达,结果表明PRC1在结肠腺癌中明显高表达,PRC1高表达与患者的淋巴结转移、肿瘤大小及TNM分期相关。④生存分析显示PRC1高表达的患者生存时间明显差于PRC1低表达组,进一步Cox单因素与多因素分析显示PRC1高表达可以作为结肠癌判断预后的独立因素。2、①结肠癌细胞株中HCT116,SW480,HT-29运用western blot方法及荧光定量PCR方法检测PRC1表达水平,结果表明PRC1呈现高表达。通过慢病毒转染的方式在HCT116,SW480,HT-29细胞株中敲降PRC1,并且qRT-PCR及Western blot验证其敲降效率,结果表明PRC1表达明显下降。②细胞增殖功能实验表明,在HCT116,SW480,HT-29细胞株中运用MTT试验检测发现敲降PRC1后细胞生长能力明显减弱;平板克隆形成实验表明敲降PRC1后细胞的增殖能力明显减弱。③细胞周期检测结果发现,在HCT116,SW480细胞株中,敲降PRC1后G2期细胞明显增多,G1期细胞减少,显示细胞周期主要是阻滞在G2期,运用Western blot方法在PRC1敲降后HCT116和SW480细胞株中分别检测细胞周期G2期相关基因的蛋白水平的改变,发现细胞周期负调控因子（P21,P27）蛋白水平明显上调,而周期正调控相关因子（cdc25c,CyclinB1,cdc2）蛋白水平明显下调。④在HCT116和SW480细胞株中,运用Annexin-VPI复染法检测发现PRC1敲降后凋亡细胞数明显增多,运用Western blot方法在PRC 1敲降后HCT116和SW480细胞株中抗凋亡因子Procaspase3,PARP,Bcl-xl,Bc12蛋白水平下调,而促凋亡因子Cleaved caspase3、Bax水平上升。3、经过慢病毒感染后的HCT116细胞注射裸鼠皮下瘤6天后开始观察裸鼠皮下瘤生长情况,至第21天,与对照组相比,shRNA-PRC1组的皮下瘤生长速度减慢,体积明显减小。并随时间的延长,两组间的差异逐渐增大。结论:1、PRC1在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常结肠组织,其蛋白质水平高表达与结肠癌患者淋巴结转移、肿瘤大小及TNM分期明显相关,PRC1蛋白高表达可作为结肠癌患者的独立的差预后因素。2、体外细胞实验结果表明PRC1可促进结肠癌细胞增殖能力及抑制细胞凋亡。在结肠癌细胞系内,PRC1抑制能够导致结肠癌细胞周期G2期阻滞。PRC1促进肿瘤生长的机制是通过抑制细胞凋亡及促进细胞周期胞质分裂进展促进细胞增殖来实现的。在两种肿瘤组织中分别对细胞周期调控因子cdc2,cyclinB1和Ki-67进行免疫组化染色,结果表明PRC1敲降后肿瘤组织中cdc2,cyclinB1和Ki-67的染色强度明显降低。3、体内成瘤实验证实PRC1可促进结肠癌细胞的增殖。