研究背景及意义:胚胎着床（Embryo implantation）是指受精卵发育成囊胚（Blastocyst）后植入母体子宫内膜的过程,也称为囊胚植入。胚胎着床是哺乳动物生殖过程中最为关键且极其复杂的步骤之一。有调查研究表明,人群中75%以上的不孕是由胚胎着床失败导致的,因此,胚胎着床障碍是人类不孕的主要原因之一。随着人类辅助生殖技术（Assisted reproduction technology,ART）,包括体外授精（In vitro fertilization,IVF）和胚胎转移（Embryo transfering,ET）技术的发展,体内受精的成功率已达到90%以上,但是ART受孕成功率仍停留在30%以下,其主要原因是着床失败。胚胎着床于子宫内膜,母体子宫内环境,是胚胎着床的必要条件。子宫内膜是位于子宫肌层之上的,面对子宫腔的连续细胞层,主要由子宫内膜上皮和间质两种组织构成。从着床前期到着床启动,胚胎和子宫内膜同步发育。几乎所有的哺乳动物的子宫内膜仅在某一特定的时期才允许胚胎着床,这段时期称为“着床窗口”（Implantation window）,此时子宫内膜对胚胎具有可受性（Uterine receptivity）。这种间质细胞蜕膜化过程是胚胎着床的必要条件。胚胎与上皮粘连后,位于上皮细胞下层的子宫内膜间质细胞随即发生分化过程——蜕膜化（Decidualization）。蜕膜细胞为妊娠早期胚胎发育提供养分,并对妊娠后期胎盘的形成、胚胎发育具有重要的作用。蜕膜化不良将导致妊娠后期疾病,如胎盘供血不足、妊娠子痫、早产甚至是死胎的严重后果。目前研究发现了与胚胎着床有关的一系列相关基因和信号分子,包括白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor,LIF）、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARy）、同源框基因 A10（Homebox）、胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IgF2）和紧密连接蛋白4（Claudin 4）等,但这些基因和信号分子在胚胎着床过程中具体机制尚未阐明。值得注意的是,高度保守的Wrnt信号通路在整个胚胎发育期间细胞与细胞交互作用中起极其关键调节作用。子宫内Wnt/beta-catenin经典通路激活于胚胎着床时期和着床位点,提示该通路可能对参与了胚胎着床具有重要的作用。然而,与Wnt相关的胚胎着床中的信号转导机制,例如该通路是如何被激活的,目前仍未被阐明。除了以上提到的着床相关因子之外,越来越多的实验证据显示,前列腺素（Prostaglandins,PGs）是影响胚胎着床的重要分子。PGs是一类具有生物活性的不饱和脂肪酸,在很多细胞反应和生理过程中,如炎症免疫反应,肌肉收缩和细胞增殖分化等,发挥着重要的作用。PGs在细胞内的合成过程受到一系列合成酶的严密调控。膜磷脂在磷脂酶A2（Phospholipase A2,PLA-2）的催化下水解生成花生四烯酸,经环加氧酶I或II（Cyclooxygenase,COX-1 orCOX-2）的作用形成不稳定的PGH2,随后再转变成具有生物活性的前列腺素,包括PGD2,PGE2,PGF2α,PGI2和血栓素（TXA2）。Pla-2和Cox-2基因敲除分别可导致雌性小鼠不育,说明PGs在女性生殖过程中发挥了极其重要的作用。其中,由COX-2调控产生的PGE2,在胚胎着床过程,尤其是子宫内膜间质细胞蜕膜化中,起到了关键性的作用。蜕膜化是一个复杂的,多因素参与的过程,是胚胎着床的必要条件。PGE2是推进蜕膜化最重要的分子之一,其通过激活间质细胞膜上的前列腺素受体（EP）,升高胞内cAMP水平,从而激活了一系列蜕膜化所需的细胞反应和相关基因表达。然而,目前还不清楚囊胚信号（物理或化学）是如何从子宫内膜上皮细胞上的转化成化学信号例如PGs,从而作用于间质细胞发生蜕膜化的,然而间质细胞是没有接触到这些囊胚信号的。我们最近的研究发现子宫内膜上皮钠通道（Epithelial Sodium Channel,ENaC）可以通过介导囊胚的信号促使了上皮细胞产生和释放PGE2,从而推进间质细胞蜕膜化,在胚胎着床中发挥了关键性的作用。ENaC,也成为非神经性类钠离子通道蛋白Ⅰ（Sodium Channel Non-neuronal 1,SCNN1）或阿米洛利敏感的 Na 通道（amiloride-sensitive sodium channel,ASSC）,由α、β和γ三种亚基组成,广泛分布在机体各种上皮组织中。ENaC的主要功能是介导上皮细胞（如呼吸道和肾小管上皮细胞）从官腔中吸收Na离子进入循环系统,从而带动水分的吸收。在人类,小鼠和猪的子宫内膜上也观察到ENaC的吸收水分的现象。子宫间质蜕膜化过程可被机械性刺激所激活,大量的丝氨酸蛋白酶在蜕膜化过程中表达在囊胚和子宫内膜上皮细胞中间。研究表明,ENaC的通道活性可以被机械刺激或者蛋白酶激活,介导了来自囊胚的信号,导致Na+内流,产生细胞膜电位去极化,从而激活电压依赖的Ca2+通道,引起Ca2+内流,进而激活了一系列细胞内信号转导通路,促进cAMP/Ca2+反应元件结合蛋白（cAMP/Ca2+responseelement-bindingprotein,CREB）的磷酸化,激活其转录因子的活性,被激活的CREB启动COX-2基因转录,COX-2表达及活性增强导致PGE2合成及释放。更重要的是,我们的结果显示,辅助生殖失败的病人子宫内膜ENaC的表达水平较成功组显著降低,进一步提示了 ENaC在胚胎着床中的重要性。那么子宫内膜上皮细胞产生的PGE2,很难以自由扩散通过质膜发挥作用,它是如何从细胞内释放出来传递到间质细胞的?近年来发现多药耐药相关蛋白4（Multidrug Resistance protein 4,MRP4）能转运 PGs,特别 PGE2 是 MRP4 的高亲和转运底物。MRP4是三磷酸腺苷结合盒转运蛋白C亚型（ATP-binding Cassette transporter C,ABCC）家族成员之一,是一种跨膜转运蛋白,主要功能是将内源性和外源性有机阴离子化合物从细胞中运送至细胞外。MRP4在全身各组织器官均有表达。MRP4在极性细胞中既可以表达在细胞膜的顶膜面,也可以出现在细胞的基底膜面,这取决于细胞的类型,说明MRP4具有多方面的转运功能。MRP4是ABC转运蛋白家族中转运底物涵盖范围最广的蛋白,它主要表现在对正常细胞、器官的保护和肿瘤细胞的抗性,转运一些外源性药物,如抗病毒药物、抗生素、心血管药物和细胞毒性剂等。同时又能转运内源性化学物物质,包括了环腺苷酸类、前列腺素类和共轭类固醇激素等重要的细胞内或细胞间信号分子。在前列腺素中,PGE2是MRP4的高亲和转运底物。有研究报道,MRP4除了转运PGE2,还可能参与了调节前列腺素的合成和功能,最近研究发现在食道癌细胞上敲低MRP4能抑制COX-2的转录和降低前列腺素受体EP1和EP2的表达。尽管其中的分子机制还未阐明,但这些结果提示,MRP4不仅通过转运PGE2介导细胞间信号转导,还具有潜在的直接调控细胞内信号通路的能力。如前文所述,PGE2和细胞间信号传导在胚胎着床中发挥了关键性作用,我们假设MRP4很有可能参与了胚胎着床的过程。目前,MRP4相关研究大多集中在关于对抗肿瘤药物的转运功能上。目前MRP4在女性生殖道作用的研究还相当缺乏,在胚胎着床过程中的作用还没有研究。如上所述,PGs是胚胎着床中的重要分子,MRP4作为PGs的重要转运蛋白,是否对胚胎着床是重要的?它是否参与了由ENaC介导的、PGs参与的胚胎着床相关信号转导通路的激活与传递?它在着床中如何发挥其作用?能否与其他着床相关基因相互联系、相互作用?这些问题都有待科学验证。综上所述,我们之前研究发现子宫内膜上皮细胞中的ENaC介导了来自胚胎的信号,激活COX-2产生PGE2;从上皮细胞来源的PGE2对间质细胞蜕膜化和胚胎着床起到了关键性的推动作用。基于MRP4是PGs重要的转运蛋白,我们提出以下假设:MRP4可能介导了 PGs从上皮向间质细胞转运的过程,参与ENaC/PGs相关信号转导通路,并影响胚胎着床基因的表达,从而对胚胎着床起到了关键性的作用。方法:我们用人子宫内膜上皮细胞（HES细胞）为体外细胞模型,HES细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃,5%CO2条件下的培养箱中培养。用Lipofectamine 2000脂质体为转染试剂将siRNAMRP4转染进HES细胞来作MRP4的基因沉默。用PGE2 ELISA来检测细胞外所释放的PGE2的含量,培养基为无血清培养基。RT-PCR和real-time PCR主要检测MRP4,COX-2和胚胎着床相关基因的mRNA转录水平。Western blot实验检测HES细胞或子宫组织中的 MRP4,p-CREB,COX-2,beta-catenin,Active beta-catenin,TCF1和tubulin的蛋白表达水平。我们用小鼠体内整体实验来研究胚胎着床过程。子宫腔内注射siRNAMRP4来敲低子宫内膜MRP4的表达。子宫腔内注射药物（MK-571）或siRNAMRP4来干扰胚胎着床的过程,子宫组织取出保存可进行下一次实验。组织免疫荧光实验检测MRP4的在小鼠子宫上的位置和表达,进行形态学观察。结果:RT-PCR和real-time PCR实验检测HES细胞中MRP4和COX-2的mRNA转录水平在ENaC激活剂Trypsin（20μg/mL）处理后显著升高（F=59.456,p<0.001;F=226.736,p<0.001）,且该作用可以被 ENaC 抑制剂 Amiloride（10 μM）阻断,表明了 MRP4的转录水平受ENaC激活调节。ELISA实验在Trypsin处理HES细胞后,培养液中PGE2的含量显著增加近十倍与不加Trypsin（20μg/mL）的对照组相比,而这一培养液中PGE2含量的增加在HES/MK-571组和HES/siRNAMRP4组显著地降低相比较对照组（HES/MK-571组中对照组PGE2含量 430.343±32.83,实验组 200.176±15.197,F=103.021,p<0.001;HES/siRNAMRP4 组中对照组 PGE2 含量 677.216±38.706,实验组 339.918±6.843,F=237.945,p<0.001）。Western Blott 实验结果分析显示,siRNAMRP4 处理的HES细胞中的基础状态下的p-CREB水平显著低于siRNANC处理的细胞。另外,Trypsin处理HES细胞后,即HES细胞中ENaC被激活后,p-CREB的水平显著上升（F=238.757,p<0.001）,而且Trypsin引起的p-CREB上升作用在MRP4被敲低后显著受抑制。Real-time PCR结果显示,在HES细胞中转染siRNAMRP4敲低MRP4表达后,着床相关基因Claudin4、Lif、PPARγ的mRNA水平较HES/siRNANC 对照组显著地下降（t=13.974,p<0.001;t=11.572,p<0.001;t=3.743,p=0.02）。我们使用小鼠胚胎着床模型进一步验证MRP4在胚胎着床中的重要性。检测MRP4在小鼠围着床期（受孕2-6天）子宫内的表达情况。Western Blott实验结果显示,小鼠子宫内MRP4的蛋白水平逐渐升高于第4天午夜（着床启动）和第5天（蜕膜化启动）达到峰值,随后于第6天恢复至较低水平,同时组织免疫荧光结果发现MRP4的表达集中在子宫内膜上皮细胞基侧膜,处于上皮细胞与间质细胞的分界面,提示MRP4介导PGE2从上皮向间质细胞的转运。为了证明MRP4在参与了胚胎着床过程,我们进行了以下整体动物体内实验,子宫腔内注射MK-571。结果显示,与相应的对照组相比,子宫腔内分别注射不同浓度的MK-571（0.5 mM,1mM和5 mM）后,能显著地降低子宫腔内着床的胚胎数目（0.5 mM对照组胚胎着床数7±1,实验组1.667±0.333,t=5.06,p=0.007;1mM对照组胚胎着床数 6.333±0.667,实验组 2.667±0.667,t=3.889,p=0.018;5 mM 对照组胚胎着床数6±1.354,实验组0±0）。我们采用了动物体内RNAi干扰技术进一步排除MK-571的非特异性作用。首先,我们用western blotting技术检测子宫MRP4的蛋白表达水平来确认体内siRNAMRP4的效果,结果显示转染siRNAMRP4的第5天和第6天的子宫内MRP4蛋白表达水平较阴性对照siRNANC显著下降。组织免疫荧光染色观察发现转染siRNAMRP4组的第4天的子宫内MPR4的荧光强度明显低于siRNANC对照组,这结果进一步证明了子宫腔内注射siRNAMRP4降低MRP4的蛋白表达水平。受孕第7天计算子宫角的着床胚胎数目,注射转染siRNAMRP4（50nM和100nM）一侧的子宫腔内的着床胚胎数较阴性对照组siRNANC 一侧的显著下降（50 nM对照组胚胎着床数6.714±1.107,实验组 3.286±0.808,t=2.502,p=0.028;100nM对照组胚胎着床数 8.5±0.289,实验组 3.5±0.866,t=5.477,p=0.002）。Real-time PCR 实验分析,转染siRNAMRP4的子宫内Lif,HoxAl0,PPARy和IgF2等基因的mRNA表达水平较阴性对照 siRNANC 显著下降（t=:4.512,p=0.011;t=52.575,p<0.001;t=18,p<0.001;t=4.684,p=0.009）,与体外 HES 细胞上的结果一致。我们检验MRP4在胚胎着床中对Wnt/beta-catenin通路的调节作用。Real-time PCR 结果显示,Wnt/beta-catenin 通路上游的 Fzdl,Fzd2,Fzd4,Fzd5,Fzd6,Fzd7,Fzdl0和LRP5的mRNA水平在siRNAMRP4处理细胞中显著低于siRNANC 处理的对照组（t=3.408,p=0.027;t=8.298,p=0.001;t=5.22,p=0.006;t=7.416,p=0.002;t=47.701,p<0.001;t=4.546,p=0.01;t=13.491,p=0.004;t=10.479,p<0.001）。Western blotting结果分析得到siRNAMRP4处理的HES细胞中beta-catenin总量、活化beta-catenin和TCF1表达水平均较siRNANC转染的对照组显著降低。更重要的是,Wnt3a（100ng/mL）或CHIR-99021（10μM）处理24h后,siRNANC转染的对照组细胞中的beta-catenin总量、活化beta-catenin和TCF1水平显著升高,然而,Wnt3a和CHIR-99021这种激活作用在siRNAMRP4处理的细胞中受到显著性抑制。这一结果提示了 MRP4可能通过调节Wnt/beta-catenin通路来参与胚胎着床过程。小鼠体内实验发现CHIR-99021在100 μM,10μM和1 μM能提高子宫腔内敲低MRP4所降低的胚胎着床数（100μM组中对照组胚胎着床数 3.429±1.11,实验组 7.714±0.865,t=3.046,p=0.01;10μM 组中对照组胚胎着床数2.75±0.75,实验组 5.875±0.718,t=3.01,p=0.009;1μM 组中对照组胚胎着床数 3.667±0.989,实验组 7±0.931,t:=2.454,p=0.034）,CHIR-99021在0.1 μM没有作用效果（对照组胚胎着床数1.6±0.6,实验组1.6±0.812,t=0,p=l）。结论:MRP4一直是研究开发治疗癌症和肿瘤化疗耐药的重要靶标。本题研究了 MRP4蛋白在胚胎着床中鲜为人知的作用。实验结果表明MRP4于胚胎着床启动和蜕膜化启动时在子宫内膜上皮细胞的基侧膜面高表达,而且MRP4参与了 ENaC介导和调节胚胎着床和蜕膜化过程中信号分子PGE2的释放,将胞内合成的PGE2转运至上皮与间质细胞间,激活间质细胞信号转导,促进蜕膜化的进程。此外,MRP4是通过作用于上皮细胞内前列腺素的合成系统p-CREB/COX-2/PGE2,增强PGE2的合成。更重要的是,MRP4可以通过调节胚胎着床相关信号通路Wnt/beta-catenin经典通路从而影响胚胎着床。本论文首次阐明了 MRP4参与了胚胎着床的过程,为胚胎着床中信号传导的分子机制提出了新的观点,并为诊断、预防和治疗相关疾病新手段的开发提供一定的理论依据。另外,有关MRP4对Wnt/beta-catenin通路的调节作用的发现,不仅深入了对胚胎着床分子机制的理解,并且对探讨与Wnt/beta-catenin通路相关的其它生理病理过程包括发育和癌症等的分子机制具有更深远意义及潜在的临床价值。