研究背景:二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）是一种人体必需但自身不能合成的ω-3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）,参与细胞膜流动性维持、突触传递、脑葡萄糖摄取、神经发育、记忆和认知等诸多重要生理过程。DHA最初以抗炎功效而闻名,它可以通过减少免疫细胞的粘附和外渗、抑制活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生、降低细胞因子白介素1（Interleukin-1,IL-1）的表达等方式达到抑制炎症反应的目的。细胞焦亡是一种调控性细胞死亡,依赖于Gasdermin（GSDM）蛋白家族成员形成的质膜孔道,而GSDM家族成员的活化通常（但并非总是）由炎性胱天蛋白酶（Caspase）的活化而导致。细胞焦亡包括依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/-5/-11的非经典途径,二者均依赖GSDMD而触发细胞焦亡,在机体免疫防御中有重要的作用。但近年来,有研究初步发现由Caspase-3导致GSDME剪切而介导的细胞焦亡,而它抗肿瘤治疗和药物开发中也有重要意义。近期,还有研究发现DHA可在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）、糖尿病、非酒精性肝病（Non-alcoholic liver disease,NALD）等疾病模型中通过调节细胞焦亡信号通路上游的炎性小体以减轻炎症反应。此外,也有研究发现DHA可诱导小胶质细胞和乳腺癌细胞发生细胞焦亡。由此推测,DHA对细胞焦亡的调控作用具有一定普遍意义,也可能会出现在其他多种细胞中,但其具体作用机制尚不清楚。因此,本文以THP-1单核细胞（THP-1 monocytes）、THP-1巨噬细胞（THP-1 macrophages,由THP-1单核细胞经PMA诱导分化而成）和人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）为研究对象,从细胞水平探讨DHA是否诱导细胞焦亡及其具体调控机制。第一部分DHA阻断THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的经典焦亡通路目的:探究10种已报道的抗炎物质（DHA、姜黄素（Curcumin）、EPA、SFN、阿托伐他汀（Atorvastatin）、葛根素（Puerarin）、和厚朴酚（Honokiol）、青蒿素（Artemisinin）、JTE013（鞘氨醇1-磷酸2拮抗剂）和黏液膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1抑制剂2（Mucosa-associated-lymphoid-tissue lymphoma-translocation gene 1 inhibitor 2,MI-2）是否可调节经典细胞焦亡通路;其次,探究DHA是如何对经典细胞焦亡进行调节的机制;最后,初步探索DHA对正常细胞和肿瘤细胞的毒性作用是否有区别。方法:1）分别用Curcumin、EPA、DHA、SFN、Atorvastatin、Puerarin、Honokiol、Artemisinin、JTE013、MI-2等10种药物处理THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞,western blot方法检测细胞焦亡相关分子NLRP3（Pyrin domain containing protein 3）、Caspase-1、GSDMD,以及凋亡因子Caspase-3以筛选可调节细胞焦亡的抗炎物质;在THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞中,分别经不同浓度的DHA（0、10、25、50、100、200μM）处理16小时,以及50μM DHA作用不同时间（0、2、4、8、16、24小时）处理后,western blot检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD的表达;2)经0、10、25、50、100、200μM浓度的DHA分别预处理THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞1小时,接着用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）处理3小时,再用尼日利亚菌素处理1小时（用于构建经典细胞焦亡模型）,western blot检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达;3)显微镜下观察不同浓度（0、10、25、50、100、200μM）DHA作用后的THP-1单核细胞形态学变化,并对台盼蓝染色染色阳性细胞计数,统计阳性细胞率;4)采用CCK-8试验和细胞毒性试验检测不同浓度DHA（0、10、25、50、100、200μM）对THP-1单核细胞的毒性作用;PI细胞染色,并镜下观察DHA（0、10、200μM）处理后THP-1单核细胞的死亡情况,并用Image J软件进行PI阳性细胞计数,并计算阳性率;5)采用CCK-8试验检测不同浓度DHA分别作用从健康人静脉血中分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）的细胞活力;采用PI细胞核活染和流式细胞计数法,进一步检测不同浓度的DHA对PBMCs的毒性作用,并比较50μM DHA分别作用PBMCs以及单核-巨噬细胞类肿瘤细胞THP-1单核细胞后的差异。结果:1)在10种抗炎物质DHA、Curcumin、EPA、SFN、Atorvastatin、Puerarin、Honokiol、Artemisinin、JTE013、MI-2中,DHA和SFN可调节THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞中的经典细胞焦亡信号通路,下调NLRP3、Caspase-1的表达（差异有统计学意义）,可将GSDMD剪切成p43片段（GSDMD-C）,并上调Cleaved Caspase-3的表达;NLRP3、Caspase-1的表达随着DHA作用浓度的增加而降低,尤其在200?M时显著降低,GSDMD-C片段含量则随着DHA浓度的增加而增加;当DHA为50?M时,NLRP3、Caspase-1的表达随着DHA作用时间的增加而降低,GSDMD-C片段含量则随之显著增加（差异有统计学意义）;2)在这THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞中,一定浓度（10-100μM）的DHA可抑制由LPS-尼日利亚菌素引起的Caspase-1、GSDMD和IL-1β剪切带的产生;3)显微镜下观察发现,当DHA浓度大于等于50μM时,THP-1单核细胞出现肿大、破裂和死亡,呈典型细胞焦亡特征;当DHA浓度大于等于25μM时,THP-1单核细胞台盼蓝染色阳性细胞率随着浓度的增加而显著升高;4)CCK-8结果显示DHA浓度大于等于25μM时,THP-1单核细胞的OD₄₅₀值随DHA浓度增加而降低（差异有统计学意义）;细胞毒性实验结果显示,THP-1单核细胞毒性随着DHA浓度增加而显著增加（差异有统计学意义）;此外,镜下观察发现,当DHA浓度为200μM时,PI细胞染色阳性率大于90%;5)在人PBMCs中,当DHA浓度大于等于50μM时,CCK-8试验结果显示OD₄₅₀值随着DHA浓度的增加而下降（差异有统计学意义）,且流式分析发现PI阳性细胞率逐渐增加（差异有统计学意义）;与THP-1单核细胞相比,当DHA浓度为50μM时,人PBMCs的PI阳性细胞率显著降低（差异有统计学意义）。结论:1)50μM DHA和SFN均可在THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞中阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典细胞焦亡通路:下调NLRP3和Caspase-1的表达而减少上游炎性小体的形成,同时将GSDMD切割成不具毒性作用的GSDMD-C片段从而阻断细胞焦亡效应分子的活化;2)DHA在不同浓度范围内既可以发挥抗经典细胞焦亡作用又可以促进细胞焦亡:DHA在一定浓度（10-50μM）可抵抗由LPS-尼日利亚菌素所导致的THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞焦亡,降低炎性因子IL-1β的表达和释放,从而使细胞免于死亡;当DHA单独作用浓度为50、100、200μM时,则表现出可诱导THP-1单核细胞发生细胞焦亡相关现象;3)高浓度DHA对人PBMCs有一定毒性作用;与正常细胞（PBMCs）相比,50μM DHA更容易引起THP-1单核细胞的死亡。第二部分DHA诱导THP-1单核细胞GSDME焦亡通路目的:探究DHA诱导THP-1单核细胞焦亡的具体机制。方法:1)DHA不同浓度（0、10、25、50μM）和作用时间（0、2、4、8、16、24小时）处理THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞后,western blot方法检测DHA对Caspase-3/-7/-8以及GSDME的表达;2)用Z-VAD-FMK（泛Caspase抑制剂）和Z-DEVD-FMK（Caspase-3抑制剂）预处理THP-1单核细胞后,继续用50μM DHA处理16小时,采用PI染色和流式细胞术检测PI阳性细胞率;并用western blot检测GSDME以及凋亡相关分子Caspase-3/-7/-8/-9、PARP的表达情况;3)用二十五碳六烯酸（EPA）、花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）、油酸（Oleic acid,OA）、γ-亚麻酸（γ-Linolenic acid,GLA）、棕榈酸（Palmitic acid,PA）和肉豆蔻酸（Myristic acid,MA）等6种脂肪酸分别处理THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞16小时后,用western blot方法检测以上脂肪酸对细胞内NLRP3、GSDMD、GSDME和凋亡因子Caspase-3的表达;4)分别用参与DHA代谢通路的5种氧化酶抑制剂如去甲二氢化愈创木酸（Nordihydroguaiaretic acid,NDGA）、黄芩素（Baicalein）、PD176146、COX 2 V FK3311、MK886（依次对应5-脂氧酶、12-脂氧酶、15-脂氧酶、环氧酶-2、泛脂氧酶）预处理THP-1单核细胞1小时,接着用DHA再作用16小时后,采用western blot检测细胞焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDME和凋亡因子Caspase-3的表达情况;5)将DHA的3种胞内最终代谢产物（Maresin 1、Resolvin D1和Protectin D1）分别以3种不同浓度（50、100和200 n M）作用于THP-1单核细胞,western blot方法检测THP-1单核细胞内细胞焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDME和凋亡因子Caspase-3的表达。结果:1)当DHA作用浓度大于等于10μM时,THP-1单核细胞出现剪切的Caspase-7/-8/-3和GSDME-N片段,且DHA浓度为50μM时剪切的Caspase-7/-8/-3和GSDME-N片段含量明显增加（差异有统计学意义）;另外,当DHA浓度为50μM时,Caspase-7/-8在DHA作用2小时后开始活化,Caspase-3和GSDME则在作用4小时后才开始被激活,且活性片段表达量在作用后16和24小时显著增加（差异有统计学意义）;在THP-1巨噬细胞中,DHA浓度为10μM时GSDME就开始活化,50μM作用2小时即可检测到GSDME-N片段,且随DHA作用浓度的增加和时间的延长而增加（差异有统计学意义）;2)Z-VAD-FMK和Z-DEVD-FMK均可降低THP-1单核细胞中PI阳性细胞的百分率,并抑制GSDME-N片段的形成（差异有统计学意义）;在DHA处理的THP-1单核细胞中,Z-VAD-FMK和Z-DEVD-FMK可抑制PARP、Caspase-9/-8/-7/-3蛋白的下调;3)EPA、AA、OA、GLA、PA和MA等6种脂肪酸均不能降低NLRP3、Caspase-1的表达,也不能引起GSDMD、GSDME和Caspase-3剪切;4)参与DHA代谢通路相关的5种氧化酶抑制剂NDGA、Baicalein、PD176146、COX 2 V FK3311、MK886（依次对应5-脂氧酶、12-脂氧酶、15-脂氧酶、环氧酶-2、泛脂氧酶）对THP-1单核细胞后和THP-1巨噬细胞NLRP3、Caspase-1的表达均没有影响,同时也不能抑制GSDMD、GSDME和Caspase-3的剪切;5)在THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞中,3种不同的DHA胞内最终代谢产物Maresin 1、Resolvin D1和Protectin D1均不能导致经典细胞焦亡途径NLRP3/Caspase-1/GSDMD的阻断,以及由Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡途径的激活。结论:1)本文首次发现DHA诱导THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞发生细胞焦亡;在THP-1单核细胞中,DHA通过激活Caspase-3/GSDME通路诱导细胞焦亡。2)DHA胞内代谢通路中的氧化酶以及胞内最终代谢产物均不能诱导THP-1单核细胞焦亡。第三部分DHA诱导HUVECs细胞焦亡目的:探究细胞焦亡信号通路中的相关分子在不同细胞系中（原代内皮细胞、单核-巨噬细胞类肿瘤细胞、非单核-巨噬细胞类肿瘤细胞）的基础表达水平,以及DHA在HUVECs细胞焦亡的作用。方法:1)在5种人原代内皮细胞（HUVECs、HCAECs、HAECs、HLMECs、HDMECs）、3种单核-巨噬细胞类肿瘤细胞（THP-1单核细胞、U937、RAW264.7）以及5种非单核-巨噬细胞类肿瘤细胞（HEK293T、Hela、A549、3T3、COS-7）中,采用western blot方法检测4种细胞焦亡经典信号通路相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β及5种GSDM家族成员（GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME、DFNB59）的基础表达水平;2)分别用1μ/mL LPS、10 ng/mL TNF-α、25 m M葡萄糖（Glucose）作用HUVECs 0、1、2、4、6、8、16、24、32小时,采用western blot方法检对胞内GSDMD表达情况;3)采用western blot方法从Curcumin、DHA、SFN、Atorvastatin、Puerarin、Honokiol、Artemisinin、JTE013、MI-2等9种物质中筛选出能调节HUVECs细胞焦亡作用的抗炎物质;4)50μM DHA处理HUVECs 0、4、8、16、24小时后,用western blot检测随着DHA作用时间的延长胞内GSDMD、Caspase-1的表达情况;5)不同浓度DHA（0、10、25、50、100、200μM）或不同时间（0、4、8、16、24小时）处理HUVECs后,CCK-8试验检测细胞活性;用PI染色和荧光显微镜观察死亡细胞情况;采用western blot检测GSDME的表达情况;结果:1)与在细胞内表现为无特异性表达的凋亡因子Caspsase-3相比,细胞焦亡信号通路中的相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β只在特定的细胞系中表达;本文所涉及的4种单核-巨噬细胞类肿瘤细胞中,以上4种细胞焦亡通路相关分子均有表达;GSDMD在内皮细胞和单核-巨噬细胞类肿瘤细胞中有表达,而在本文所涉及的非单核-巨噬细胞类肿瘤细胞中只有A549细胞表达;GSDME则在正常内皮细胞、单核-巨噬细胞类肿瘤细胞和非单核-巨噬细胞类肿瘤细胞中均有表达;2)Western blot检测发现,用LPS、TNF-α、Glucose分别处理HUEVCs后,均未见GSDMD剪切片段的产生;3)在Curcumin、DHA、SFN、Atorvastatin、Puerarin、Honokiol、Artemisinin、JTE013、MI-2等9种药物中,只有DHA可导致HUVECs中GSDMD的表达异常;4)经50μM DHA处理HUVECs后,GSDMD出现剪切形成的GSDMD-C片段并随着作用时间延长逐渐增加,但Caspase-1的表达未见异常（差异有统计学意义）;显微镜下观察发现,经DHA处理的HUVECs出现细胞肿胀、破裂现象,且PI细胞核染色阳性;5)当DHA浓度大于等于50μM时,CCK-8结果显示HUVECs的OD450值随DHA作用浓度的增加而显著下降,而western blot结果显示GSDME-N片段含量显著增加;另外,经50μM DHA对HUVECs作用不同时间后,western blot结果显示GSDME-N片段含量随作用时间的延长而显著增加。结论:1)根据经典细胞焦亡信号通路相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD在原代内皮细胞、单核-巨噬细胞类肿瘤细胞和非单核-巨噬细胞类肿瘤细胞中基础表达情况,单核-巨噬细胞类肿瘤细胞具备所有经典细胞焦亡信号通路相关分子,这可能与其发挥抗病原体和参与炎症等功能紧密相关;GSDME在这些细胞中都表达;2)本文首次发现DHA可诱导HUVECs发生GSDME介导的细胞焦亡。