龙眼(Dimocarpus longan Lour.)属于无患子科龙眼属常绿木本果树,具有较高的营养价值与药用价值。龙眼胚胎发育是影响果实品质与产量的重要因素;然而龙眼胚胎发育的研究存在诸多不利因素影响,而龙眼体胚发生系统作为木本植物优良模式体系,是龙眼胚胎发育研究的良好替代材料。miR166家族是植物中特有且保守的一类miRNA,在植物生长发育、营养相变及逆境响应等方面发挥着重要的作用。因此,miR166家族在龙眼体胚发生早期中如何调控体胚的发生进程,如何通过对miR166的调控而实现对合子胚实际生产上的应用具有重要而积极的指导意义。本研究借助龙眼体胚早期发生系统,对龙眼miR166进行序列分析,初级体克隆,顺式作用元件分析;并对miR166前体及miR166成熟体进行体胚早期不同阶段及不同激素处理的胚性愈伤组织中的表达模式分析;研究龙眼体胚早期miR166a.2、miR166c和miR166f过表达和抑制表达对体胚形态影响及对应靶标和eTM的表达模式;最后利用pri-miR166编码的小肽(miPEP166 S338)处理下龙眼胚性愈伤组织,以期为miR166调控合子胚的发育提供可用于实践的方法论,同时更为实现人工调控miR166的表达在实际农艺生产中的应用奠定基础。主要研究结果如下:1 龙眼miR166家族的分子进化特性及不同组织部位时空表达分析为了解miR166基因家族的分子进化特性及其在龙眼不同组织部位的表达规律,对龙眼miR166家族成员的成熟体和前体序列及其进化、前体二级结构预测、靶基因预测以及时空表达模式进行了分析。结果表明:龙眼miR166家族含有12条成熟体序列和7个前体序列(pre-miRNA)。Mfold预测显示pre-miR166家族7个成员的序列均能形成典型稳定的茎环二级结构,成熟序列的碱基保守性高,其他位置的则保守性减弱;它们的最小折叠自由能(△G)在-35.30～-83.30 kal·mol-1。系统发育进化树分析显示,龙眼pre-miR166家族与葡萄、碧桃的pre-miR166亲缘关系更为接近。靶基因预测显示,龙眼miR166基因家族靶基因包括同源异型域-亮氨酸拉链蛋白、三角状五肽重复结构蛋白、假定蛋白、DNA指导的RNA聚合酶III亚单位RPC2、紫外线B受体等。红核子中13个器官实时荧光定量PCR显示,pre-miR166家族不同成员在龙眼生长发育进程中均有表达且表达模式不尽相同,在龙眼生长发育中可能具有分工,又有功能上的互补性,通过调控其靶标在龙眼叶、花的发育、以及果实器官的发育中可能有重要的功能。为进一步鉴定龙眼miR166在生长发育中的作用奠定基础。2龙眼miR166初级体克隆及生物信息学分析在上述基础上,对龙眼体胚发生早期miR166必基因的7条初级体(pri-miR166)进行克隆,确认其转录起始位点,并预测其潜在的smORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件。结果表明:获得3条初级体,pri-miR166 S53、pri-miR166 S78和pri-miR166S338,分别检测到1、3、1个转录起始位点,对应的碱基长度是317 bp、510(374和372)bp、436 bp;对其进行潜在smORF翻译,pri-miR166 S53编码一条长13个氨基酸序列的miPEP166S53(MLCFVDALFLIST);pri-miR166S78 三个不同转录起始位点共同编码一条29个氨基酸的miPEP166-78(MLSGSRTLLLIIFCRSNLSIQINSGSIIC);pri-miR166S338 编码一条长 53 个氨基酸序列的 miPEP166 S338(MTNSISNSPLLVPSFYIYLS FFFFFFSISLLWGMLSGSRPFAYKLSSWHHLLE)。利用生物信息学软件分析这3条基因的启动子序列发现,3条初级体转录起始位点上游-30 bp处均含有TATA-box,在TATA框上游-30～60 bp处均有CAAT-box。启动子还含有大量光响应元件(ACE、spl、Box4和chs-CMA2b等)、激素响应元件(生长素、脱落酸、乙烯和茉莉酸甲酯等)、逆境胁迫等特异作用元件(HSE、LTR、WUN-motif、MBS、Box-Wl 和 02-site 等)。3 pre-miR166和miR166在龙眼体胚发生早期不同阶段及不同激素处理下的表达模式分析利用实时荧光定量PCR的方法,对龙眼体胚发生早期不同阶段及不同激素处理下的胚性愈伤组织中的3个前体成员(pre-miR166 S53、pre-miR166S78、pre-miR166S338)及对应的 5 个成熟体成员(miR166a.2、miR166c、miR166e、miR166f、miR166h)的表达模式进行分析。实时荧光定量PCR表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,pre-miR166和miR166不同成员主要表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166和miR166不同成员表达模式不同。此外,pre-miR166不同成员随不同激素浓度的升高主要呈上调表达,miR166不同成员的表达模式不固定,表现为随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。4龙眼体胚早期miR166a.2、miR166c和miR166f过表达和抑制表达分析利用寡核苷酸技术对龙眼愈伤材料进行miR166a.2、miR166c和miR166f的过表达和抑制表达处理,对不同天数后发育为不同阶段的体胚材料进行相应的成熟体、前体、靶基因和eTMs表达模式分析。结果表明:寡核苷酸处理未能明显促进或抑制龙眼体胚的进程,没有出现明显的表征变化。但miR166a.2-agomir、miR166c-agomir和miR166f-agomir过表达处理均显著的提高龙眼体胚细胞相应成熟体的丰度,随着时间推移表达量逐渐降低,但始终比ck组的值高;miR166a.2-antagomir、miR166c-antagomir 和 miR166f-antagomir 抑制表达处理抑制了相应成熟体的表达,但效果没有过表达处理明显。另外,随着体胚细胞内miR166成熟体丰度的过量表达和抑制表达,pre-miR166、靶基因和eTMs在时空上表现出不同的调控模式应答,遵循一定的调控规律,但并非简单的正负调控。上述结果验证了miR166、pre-miR166、靶基因和eTMs间存在复杂的网络互作调控关系。5人工合成的miPEP166 S338在龙眼体胚发生早期的作用研究根据pri-miR166 S338存在的潜在smORF人工合成miPEP166 S338,用miPEP166S338处理龙眼体胚愈伤材料,以验证miPEP的生物学活性。结果表明:miPEP166S338处理未能明显促进或抑制龙眼体胚的进程,没有出现明显的表征变化。但通过对其成熟体miR166a.2定量结果分析表明,miPEP166 S338可以在24 h内快速增加miR166a.2的表达量。同时通过对前体pre-miR166 S338和靶基因的定量分析表明,pre-miR166 S338表达量的升高和靶基因表达量的降低与miR166a.2的表达量变化具有同步性。这提示我们,miPEP166 S338可能作为转录激活因子,具有快速富集miR166a.2的功能,通过对miR166a.2的过表达调控,从而实现对细胞形态建成的影响。该结果为miPEP进一步在龙眼活体胚胎中的应用奠定基础。