华东葡萄白藜芦醇—氧—甲基转移酶基因(VpROMT)克隆与功能分析

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中国野生葡萄对葡萄主要真菌病害具有极强的抗性,不仅是重要的抗病基因资源,而且拥有合成白藜芦醇(Resveratrol,Res)及其衍生物的有益基因。苯乙烯类化合物代表了植物中一类来自苯丙氨酸途径的次生代谢物。它们除了参与植物组成型和诱导型的防御机制外,几种关键的二苯乙烯还显示出重要的药理特性。紫檀芪(Pterostibene:3,5-二甲基-4’-羟基反式二苯乙烯)最近引起了极大的关注,紫檀芪不仅在植物防御反应中发挥重要作用,而且还具有抗癌、抗氧化、抗炎症等多种生物活性,在人类健康保健等领域显示出重要的研究价值和良好的应用开发前景。本研究选用华东葡萄(Vitispseudoreticulata)抗白粉病株系白河-35-1为材料,研究了白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因(VpROMT,Resveratrol-O-methyltransferase)在葡萄和白粉菌互作过程的表达变化模式;比较了白河-35-1不同组织器官中VpROMT基因的表达;鉴定了葡萄悬浮细胞中该基因对不同诱导子的响应;利用RACE技术克隆了VpROMT基因全长;应用农杆菌叶盘转化法获得共转化转基因烟草株系,分析了基因的表达活性;并检测了转基因烟草植株中白藜芦醇和紫檀芪的含量。主要结果如下:(1)在华东葡萄株系白河-35-1叶片cDNA文库构建基础上,利用RACE技术对ROMTEST进行全长克隆,并经过拼接后获得了该基因的全长序列。基因全长1382bp,开放阅读框为1074bp,推导编码358个氨基酸,将其命名为华东葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因VpROMT。GenBank登录号为JF710586。核酸序列系统进化分析结果表明,VpROMT与中国玫瑰OOMTs属于同一亚家族,并且同源性很高。(2)实时荧光定量PCR技术分析VpROMT基因在华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1叶片中受白粉菌诱导的表达。在与白粉菌互作过程中,在互作开始时表现为抑制表达,之后呈现先增强后下降的表达模式。表达最高值出现在病原菌接种后12h,达到处理前2倍以上。表示VpROMT对白粉病产生响应。(3)葡萄白河-35-1组织特异性表达结果表明,VpROMT在根、茎、叶和卷须中均有一定量的表达,该基因在葡萄不同组织器官中表达的差异性,但在根中表达最强。(4)以中国野生秋葡萄悬浮细胞为材料,研究了VpROMT基因在外界条件(MeJA、UV)刺激下的表达情况。结果表明,MeJA和紫外UV-C诱导后VpROMT活性明显增强。MeJA处理后,其表达量迅速累积并于24h表达量最高,之后迅速降低。同时分析了VpROMT对UV-B和UV-C诱导后表达水平的差异。UV-C处理后VpROMT活性增强,诱导12h时达最大值,后表达下降,其活性始终高于对照。而UV-C处理后其表达变化不大,在6h后小于对照的活性。表明MeJA、UV诱导对VpROMT均有正调控表达的特性。(5)构建了VpROMT基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化方法获得共转化VpSTS/VpROMT烟草株系32株,转化率达37%。通过对转基因植株实时荧光定量进一步分析结果表明,共转化烟草株系中能同时检测到VpSTS和VpROMT基因表达,表达量最高的为株系41。此外,单转化VpSTS和VpROMT烟草株系中能分别检测到VpSTS和VpROMT基因表达,表达量最高的株系分别为27和23,转化率分别为58.1%和56%,而对照组(转空载体烟草株系)中均没有这两个基因的表达。(6)华东葡萄VpSTS和VpROMT基因通过农杆菌叶盘转化法导入烟草后,利用HPLC检测分析了不同转化烟草株系叶片中白藜芦醇和紫檀芪的含量。结果表明,只有VpSTS/VpROMT共转化烟草株系能检测到紫檀芪的存在,其中共转化株系41中白藜芦醇和紫檀芪含量较高,分别为0.139μg.g-1和0.723μg.g-1,遗传转化研究结果证实VpROMT具有催化白藜芦醇生成紫檀芪的生物功能。
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