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[研究背景]慢性心力衰竭的患病率和死亡率很高，一直是最主要的住院病因。随着人口老龄化，心衰的负担持续增加。尽管一些新的药物在心衰的治疗方面已取得长足进展，影响死亡率和疾病进展，但是不能逆转和治疗心脏根本的病理变化。近几年，随着包括影响细胞收缩和生存的新的细胞内靶点发现、有效的基因转染方法的增加，基因治疗成为难治性心力衰竭的有效治疗策略。大量的研究证明，细胞膜和肌质网膜上几个关键调节分子的功能障碍，引起心肌细胞内钙调节的内在缺损，在心衰的发病过程中发挥了重要的作用。SERCA2a对于心肌细胞内的Ca2+调节起到了重要的作用。研究表明：腺相关病毒介导SERCA2a基因治疗对慢性心力衰竭大鼠有效。本实验的目的是在大动物心衰模型上，观察重组腺相关病毒1（rAAV1）介导的SERCA2a基因转移的有效性，探讨SERCA2a基因治疗的多种可能的机理，为基于SERCA2a的基因治疗提供了理论依据。第一部分：为建立稳定的慢性心力衰竭（CHF）比格犬的动物模型，并探讨CHF发生发展的病理生理改变，采用快速（230次／分）右心室起搏30天，之后改用180次／分的频率维持30天。20只比格犬，分为对照组（n=4）和起搏组（n=16）并应用超声心动图、血流动力学、组织病理和电镜分析，确认心力衰竭模型的建立。快速起搏30天后，起搏组比格犬的超声心动图左室射血分数、血流动力学左室收缩压（LVSP）、左室内压最大收缩率（+dp／dtmax）、左室内压最大舒张率（-dp／dtmax）与对照组相比，均显著下降（P＜0.05）；左室舒张末压（LVEDP）显著升高（P＜0.05），提示比格犬心力衰竭模型的成功建立。在以180次／分维持30天后，上述参数仍保持稳定，病理检查发现，心脏、肺脏、肝脏、肾脏、肾脏均显示慢性心力衰竭的形态学变化，提示快速右室起搏可建立稳定、持久的比格犬慢性心力衰竭模型，并有利于心衰新的治疗研究。第二部分：探讨重组1、2型腺相关病毒（rAAV1和rAAV2）载体向小鼠心脏转导效果。应用经腹心包腔内注射术，分别将携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）、荧光素酶（LUC）报告基因的rAAV1、rAAV2转导入小鼠的心包腔内，使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达、冷光CCD相机活体监测LUC在心肌表达。rAAV1-EGFP组，绿色荧光出现于心肌组织全层；rAAV2-EGFP组，绿色荧光仅局限于心外膜下少数心肌细胞。rAAV1-EGFP在小鼠心肌细胞的表达范围和强度优于rAAV2-EGFP。rAAV1-LUC基因在小鼠心肌组织表达强度、持续表达时间优于rAAV2-LUC基因。在小鼠心脏中，rAAV1是一种比rAAV2更为有效的转基因载体。第三部分：探讨SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭比格犬的有效性及可能的机理。经快速右心室起搏建立比格犬的慢性心力衰竭模型。分为4组：a对照组（n=4）；b HF组（n=4）：c HF+EGFP组（n=4）：d HF+SERCA2a组（n=8）。其中d组又分为基因导入30天和60天2个亚组，每组各4只。经开胸心肌内分别注射rAAV1-EGFP和rAAV1～SERCA2a，剂量为1×1012v.g（基因组）。基因转移后30天，使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达。在基因导入后30天和60天后，采用RT-PCR、Western-Blot及免疫组织化学染色检测SERCA2a在心肌组织的表达，同样用RT-PCR检测PLN mRNA的表达水平。在基因转移后30天后，HF+EGFP组绿色荧光出现在心肌组织中，呈小片状或散在分布，以左心室前壁表达较强。在基因转移后30天，SERCA2amRNA／GAPDHmRNA，SERCA2a／β-actin的比值较心衰组显著提高（P＜0.05），免疫组化发现，SERCA2a在心肌组织中的表达也显著高于心衰组；在基因转移60天时，SERCA2a mRNA水平和蛋白表达仍维持高水平表达。随着SERCA2a表达增加心功能也得到改善。但是，PLN mRNA的水平没有改变。本研究初步证实了rAAV1-SERCA2a能够改善慢性心力衰竭比格犬的心功能，为rAAV1-SERCA2a在心力衰竭治疗中的进一步应用奠定了基础。第四部分：观察SERCA2a基因转移对于左室重塑和凋亡的影响。实验分组与第三部分相同。用电镜观察凋亡的心肌细胞，用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡指数，并用免疫组化SP法检测Bax、MMP-9在心肌的表达。实验发现，凋亡心肌细胞的细胞核染色质呈浓缩的块状，HF组和HF+EGF组的心肌细胞凋亡指数、Bax、MMP-9与对照组相比显著增高（P＜0.05），SERCA 2a治疗后心肌细胞凋亡指数、Bax、MMP-9比HF组显著降低（P＜0.05）。本实验初步证实了SERCA2a基因转移治疗慢性心力衰竭，能够改善心功能，抑制心室重塑。